宋海英，張小雙，張現(xiàn)華，呂永健

(河北華北制藥華恒藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 051500)

青霉素V鉀屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，分子結(jié)構(gòu)主要由β-內(nèi)酰胺環(huán)和四氫噻唑環(huán)組成，其抗菌譜與青霉素G相似[1-2]，能夠破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，具有殺菌作用，是治療革蘭陽性菌及部分陰性菌感染的首選藥物[3-4]。在青霉素V鉀的工業(yè)生產(chǎn)中，由于降解反應(yīng)，會產(chǎn)生一系列的降解產(chǎn)物。在提取過程中，一些雜質(zhì)如果有效控制與去除，就不會帶入青霉素V鉀成品中，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率[5-8]。

本論文通過高效液相色譜法(HPLC)對青霉素V鉀的發(fā)酵液及提取過程中相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了跟蹤檢測[9-11]，摸清了各工序中相關(guān)雜質(zhì)的含量分布情況，并且闡明了提取過程中相關(guān)物質(zhì)的量與提取過程的關(guān)系，并追蹤了成品中主要任意其他雜質(zhì)的來源以及該雜質(zhì)的主要影響因素分析[12-15]，為生產(chǎn)中有效控制主要任意其他雜質(zhì)的量，減少青霉素V鉀的降解損失，提高青霉素V鉀成品的質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

青霉素V鉀(對照品)，本廠自制；苯氧乙酸(BR)，上海撫生實業(yè)有限公司；系統(tǒng)適用性試劑：EDQM CS；發(fā)酵液、提煉液，本廠102車間提供；磷酸二氫鉀(分析純)，天津市鼎盛鑫化工有限公司；氫氧化鈉(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈(色譜純)，天津市康科德科技有限公司；甲醇(色譜級)，美國天地；磷酸，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；水為自制純化水。

儀器：LC-15C高效液相色譜儀(HPLC)，島津；色譜柱：依利特2.7 μm，4.6 mm×150 mm；DC-1506W低溫恒溫槽，深圳市三利化學(xué)儀器；W201恒溫水浴鍋，上海申順生物科技有限公司；DW型電動攪拌器，上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司；CS101-2ABN電熱鼓風(fēng)干燥箱，重慶永生實驗儀器廠；BT100-2J蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 研究對象

青霉素V(PCV)易發(fā)生一系列降解反應(yīng)。這些反應(yīng)包括水解、脫羧、胺的親核攻擊、聚合和碳水化合物青霉噻唑酯的形成等。已知的相關(guān)雜質(zhì)有：發(fā)酵產(chǎn)物A(青霉素)，加入的前體物質(zhì)B(苯氧乙酸)，降解產(chǎn)物C(6-氨基青霉烷酸)，青霉素V的氧化產(chǎn)物D(4-OH青霉素V)，青霉素V噻唑酸E(兩個異構(gòu)體)以及青霉素V脫羧噻唑酸F(兩個異構(gòu)體),結(jié)構(gòu)圖詳見文獻(xiàn)[11]圖1。

1.3 青霉素V鉀溶液的制備

取青霉素酸晶160 g加入1000 mL三口瓶中，加入500 mL丁醇，打開攪拌，用蠕動泵滴加15%碳酸鉀溶液，調(diào)溶液至所需pH值。將不同終點pH的成鹽溶液倒入結(jié)晶裝置中，真空共沸結(jié)晶至終點水分達(dá)到1.0%以下，停止加熱。

1.4 檢測方法

采用歐洲藥典EP9.0液相色譜法檢測青霉素V鉀，詳見《歐洲藥典EP9.0》P3315-3316。

2 結(jié)果與討論

2.1 提煉各工序中相關(guān)雜質(zhì)的檢測

根據(jù)提煉的工藝流程，用HPLC分析方法檢測各歩過程，考察提煉過程中青霉素V鉀相關(guān)物質(zhì)的變化情況，先后對發(fā)酵液、乙酸丁酯的反相(RB)、酸晶、PCV鉀濃液、母液五個工序的物料進(jìn)行分析測定，結(jié)果見表1。

表1 提煉過程中PCV及其相關(guān)物質(zhì)含量表

發(fā)酵過程中會發(fā)生氧化、水解等副反應(yīng)，發(fā)酵液中已知雜質(zhì)以青霉素噻唑酸為主，其次是未反應(yīng)的苯氧乙酸和氧化產(chǎn)物4-羥基青霉素V鉀；從濾液到RB，經(jīng)過酸化、脫色、反萃，由于PCV比較耐酸，反萃的堿化過程是在有機(jī)相中進(jìn)行，脫色BA濃度較低，因而沒有新的降解雜質(zhì)產(chǎn)生，青霉素噻唑酸部分去除，苯氧乙酸和4-羥基青霉素V鉀沒有變化；從RB到酸晶，經(jīng)過酸化處理，沒有新的雜質(zhì)產(chǎn)生，苯氧乙酸和青霉素噻唑酸大量去除，4-羥基青霉素V鉀少量殘留；從酸晶到PCV鉀濃液，經(jīng)過堿化處理，而且在很濃的狀態(tài)下，有新的任意其他雜質(zhì)產(chǎn)生(稱為雜質(zhì)1，如圖1所示)，苯氧乙酸略有減少，青霉素噻唑酸有所增加，4-羥基青霉素V鉀變化不明顯；成品中主要已知雜質(zhì)為4-羥基青霉素V鉀，還有少量任意其他雜質(zhì)(雜質(zhì)1)；PCV共沸結(jié)晶后母液中主要雜質(zhì)為雜質(zhì)1，其次為青霉素噻唑酸，說明雜質(zhì)1在青霉素V酸加堿成鹽過程中產(chǎn)生，在共沸結(jié)晶過程中增大。

圖1 PCV成鹽溶液HPLC譜圖

2.2 任意其他雜質(zhì)的影響因素考察

針對青霉素V酸制備青霉素V鉀溶液過程中產(chǎn)生的任意其他雜質(zhì)(雜質(zhì)1)，對其產(chǎn)生的條件及影響因素進(jìn)行了考察。

2.2.1 成鹽溶液pH值對雜質(zhì)1的影響

相同實驗條件下，控制PVC成鹽溶液終點pH值分別為6.2，6.5，6.8，7.0，7.2，考察不同終點pH對成鹽溶液中雜質(zhì)1的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，成鹽溶液中雜質(zhì)1隨終點pH值升高而明顯增大，說明該雜質(zhì)對堿敏感，在堿性條件下青霉素V鉀降解嚴(yán)重。因此，為了有效控制該雜質(zhì)的含量，青霉素V鉀溶液成鹽過程中pH控制在6.5～6.8為宜。

圖2 PVC成鹽溶液終點pH對溶液中雜質(zhì)1的影響

2.2.2 成鹽溶液濃度對雜質(zhì)1的影響

相同實驗條件下，將相同量的青霉素V酸晶加入不同體積丁醇中，終點pH為6.70，考察青霉素V鉀成鹽溶液濃度分別為150000 U/mL、200000 U/mL、250000 U/mL、300000 U/mL對料液中雜質(zhì)1的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可見，隨著青霉素V鉀成鹽溶液濃度的升高，溶液中雜質(zhì)1含量明顯增大，主要是由于青霉素V鉀成鹽溶液濃度越高，料液降解速度越快，雜質(zhì)1的生成量越大。由于成鹽溶液還需進(jìn)行共沸結(jié)晶，濃度與含水量直接影響結(jié)晶時間，結(jié)合能耗方面綜合考慮青霉素V鉀成鹽溶液濃度控制在300000 U/mL以內(nèi)為宜。

圖3 PVC成鹽溶液濃度對溶液中雜質(zhì)1的影響

2.2.3 加堿時間對雜質(zhì)1的影響

相同實驗條件下，控制不同的碳酸鉀滴加時間，檢測成鹽溶液中相關(guān)物質(zhì)，考察不同加堿時間10 min、20 min、30 min、40 min、50 min對料液雜質(zhì)1的影響，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著加堿時間的延長任意雜質(zhì)明顯減小，主要是由于加堿速度快會使青霉素V鉀溶液局部過堿，造成物料降解，雜質(zhì)1大量生成。延長加堿時間可以有效避免局部過堿，從而有效控制雜質(zhì)1的生成。青霉素V酸成鹽過程中適宜的加堿時間為40 min左右。

圖4 加堿時間對溶液中雜質(zhì)1的影響

3 結(jié) 論

(1)青霉素V鉀發(fā)酵液中主要雜質(zhì)為青霉素噻唑酸，其次為未反應(yīng)的苯氧乙酸和4-羥基青霉素V鉀。在提取各工序中苯氧乙酸、青霉素噻唑酸、青霉素脫羧噻唑酸可以逐步去除，4-OH青霉素V鉀為成品中最大已知雜質(zhì)，雜質(zhì)1在青霉素V酸成鹽過程中產(chǎn)生，在共沸結(jié)晶過程中明顯增大，成為成品和母液中最大未知雜質(zhì)。

(2)任意雜質(zhì)(雜質(zhì)1)受青霉素V鉀成鹽溶液終點pH值、成鹽溶液濃度、加堿時間因素影響，最佳工藝條件為：青霉素V鉀成鹽溶液終點pH值6.5～6.8，成鹽溶液濃度控制在300000 U/mL以內(nèi)，加堿時間控制在40 min左右。

(3)青霉素V鉀母液中雜質(zhì)1含量受青霉素V鉀成鹽溶液中雜質(zhì)1起始含量影響較大，因此有效控制青霉素V鉀成鹽條件是控制任意雜質(zhì)(雜質(zhì)1)，減少青霉素V鉀的降解的重要措施。