任彩君 趙柳微 王凱 薛曉鋒 趙艷萍 吳黎明

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所；2 山西玉漿堂蜂業(yè)科技有限公司）

1 引言

翅果油樹(shù)（拉丁學(xué)名：Elaeagnus mollis Diels.）是胡頹子科胡頹子屬落葉直立喬木或灌木，屬?lài)?guó)家一類(lèi)保護(hù)樹(shù)種，僅在中國(guó)山西和陜西兩地有少量分布。翅果油樹(shù)的種子、樹(shù)葉等部位含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中樹(shù)葉中不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的77%以上，亞麻酸占不飽和脂肪酸的70%以上[1,2]。翅果油樹(shù)開(kāi)花早，花蜜含量大，花粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是一種理想的蜜源植物。

翅果油蜂蜜是蜜蜂從翅果油花中采集花蜜，并在蜂巢中充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[3]。分析發(fā)現(xiàn)，翅果油蜂蜜中富含維生素、脂肪酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶和蔗糖酶等人體代謝不可缺少的物質(zhì)，適合補(bǔ)給免疫力低下人群[4,5]，同時(shí)還具有改善尿頻、睡眠和調(diào)節(jié)胃腸道功能等作用[5]，是一種產(chǎn)量較少的優(yōu)質(zhì)特色蜂蜜。但目前還未形成翅果油蜂蜜特征鑒別技術(shù)，有被摻假的潛在風(fēng)險(xiǎn)，也無(wú)法從功能組分角度與其他種類(lèi)蜂蜜區(qū)分。

近幾年，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)建立了鑒別不同蜂蜜特征與功能的成熟方法和應(yīng)用模型。本研究利用代謝組學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析技術(shù)，對(duì)翅果油蜂蜜、翅果油樹(shù)的花所含化合物進(jìn)行異同比對(duì)，旨在探究翅果油蜂蜜中的特征識(shí)別物，提供針對(duì)翅果油蜂蜜的鑒別方法并確定蜂蜜特征物的閾值范圍，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用翅果油蜂蜜提供技術(shù)支撐。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

Milii-Q純水機(jī)，美國(guó)Millinpore公司；電子分析天平，METTLER-TOLEDO公司；混合振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造責(zé)任有限公司；N-EVAP112氮?dú)獯蹈蓛x，美國(guó)OA-SYS公司；超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS，6545），美國(guó)安捷倫科技有限公司。

色譜級(jí)甲醇，F(xiàn)isher公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱，Waters公司；0.22μm尼龍膜，津騰公司。

分析樣品：2018年、2019年從山西翼城的翅果油種植區(qū)域周邊的蜂場(chǎng)，采集翅果油蜂蜜，共36個(gè)樣品，同時(shí)采集了相同地點(diǎn)的翅果油樹(shù)的花樣品12個(gè)。實(shí)驗(yàn)室備存的油菜、洋槐、棗花蜂蜜各3個(gè)樣品，共9個(gè)樣品。

2.2 樣品前處理

稱(chēng)取蜂蜜樣品各5g，加入10ml去離子水，震蕩溶解后60kHz功率超聲10min。將樣品加入預(yù)先用5ml甲醇和5ml純水活化的C18固相萃取小柱，調(diào)節(jié)流速1～1.5ml/min，待樣品溶液全部流出后，用10ml純水淋洗C18小柱，負(fù)壓下抽干。用8ml甲醇洗脫，收集洗脫液，常溫下氮?dú)獯蹈?。?ml甲醇復(fù)溶，0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。

翅果油樹(shù)的花/芽研磨成粉末，分別稱(chēng)取2g加入10ml甲醇，8000g離心10min，取上清液，0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。

2.3 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)的條件

色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1×100mm，1.8μm）；流動(dòng)相為含0.1%甲酸水溶液（A）、含0.1%甲酸乙腈溶液（B）；進(jìn)樣量2μl；柱溫40℃；流速0.3ml/min。

質(zhì)譜條件：ESI離子源；載氣溫度320℃；氣體流速8l/min；噴霧器壓力40psi；毛細(xì)管電壓3500V；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 l/min；負(fù)離子掃描模式。

表1 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與討論

由于翅果油蜂蜜是蜜蜂采集翅果油花的花蜜并在蜂巢中經(jīng)過(guò)充分釀造而成的，因此考慮翅果油蜂蜜特征物與翅果油花密切相關(guān)[6,7]。將翅果油蜂蜜與翅果油植物花中的化學(xué)組分進(jìn)行對(duì)比，找到兩者并存的化合物，發(fā)現(xiàn)共有170多種化合物，通過(guò)Metlin數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，找出匹配度大于85%的化合物，作進(jìn)一步篩選并利用保留時(shí)間和化合物精確質(zhì)量數(shù)兩個(gè)指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確認(rèn)，α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品及蜂蜜中對(duì)應(yīng)的提取離子m/z277.2173、保留時(shí)間18.2min，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2，亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品及蜂蜜中對(duì)應(yīng)的提取離子m/z279.2330、保留時(shí)間19.1min，色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖1 α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品提取離子m/z277.2173色譜圖

圖2 翅果油蜂蜜提取離子m/z277.2173色譜圖

圖3 亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品提取離子m/z279.2330色譜圖

圖4 翅果油蜂蜜提取離子m/z279.2330色譜圖

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，李喬等在翅果油樹(shù)葉中檢出α-亞麻酸[8]，宋雙紅等在翅果油樹(shù)種子油中檢出亞油酸[9]，馮寶英在翅果油樹(shù)種仁中檢出亞油酸[10]。本研究從翅果油蜂蜜中檢出α-亞麻酸、亞油酸，表明翅果油蜂蜜與翅果油植物不同部位共同含有α-亞麻酸、亞油酸。但有研究表明，個(gè)別品種蜂蜜中也含有α-亞麻酸、亞油酸[11-13]。本研究也在油菜、洋槐、棗花蜂蜜中檢出少量α-亞麻酸、亞油酸，單獨(dú)以蜂蜜中是否含有α-亞麻酸、亞油酸難以判定是否為翅果油蜂蜜。

為此，我們采用定量法進(jìn)一步確定了翅果油蜂蜜中α-亞麻酸、亞油酸含量，發(fā)現(xiàn)所有翅果油蜂蜜樣品的α-亞麻酸含量均不小于100mg/kg、亞油酸含量均不小于10mg/kg，且α-亞麻酸、亞油酸的濃度比在（10～13）∶1之間，與其他蜂蜜中α-亞麻酸、亞油酸濃度比在（1～3）∶1之間，存在顯著差異。因此將α-亞麻酸（≥100mg/kg）、亞油酸（≥10mg/kg）、α-亞麻酸/亞油酸濃度比（10～13）∶1，聯(lián)合作為翅果油蜂蜜特征識(shí)別參數(shù)，以提高鑒別的準(zhǔn)確性。

4 小結(jié)

本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)并結(jié)合代謝組學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段對(duì)翅果油蜂蜜的化學(xué)成分進(jìn)行分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定以α-亞麻酸、亞油酸作為翅果油蜂蜜特征識(shí)別物[14,15]，且滿(mǎn)足：α-亞麻酸含量≥100mg/kg，亞油酸含量≥10mg/kg，α亞麻酸與亞油酸濃度比在（10～13）∶1之間。利用該鑒別方法能夠準(zhǔn)確識(shí)別翅果油蜂蜜，研究方法和模型也為其他蜂蜜品種鑒別提供了可靠思路和有效辦法。

同時(shí)，翅果油蜂蜜較高的α-亞麻酸和亞油酸的濃度比（10～13）∶1，也有助于調(diào)節(jié)和平衡現(xiàn)代膳食結(jié)構(gòu)中亞油酸含量相對(duì)較高、亞麻酸含量相對(duì)較低的情況[16]，食用翅果油蜂蜜有助于人體健康。