姚秋娟，馮翯，王玉啟，范琳俐，金航，黃維，2*，鄒小興*

1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350007；2.自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350007；3.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350007

省沽油科野鴉椿屬的圓齒野鴉椿EuscaphiskonishiiHayata是我國(guó)特有的常綠小喬木，主要分布在福建、廣東、海南等東南地區(qū)，喜生于海拔1000 m左右的山谷或疏林中[1-2]。圓齒野鴉椿是福建的民間傳統(tǒng)藥材，其果實(shí)溫中理氣，可止痛消腫，常用于治療胃痛、瀉痢、脫肛、睪丸腫痛等[3-4]。其果皮中主要含有三萜[5]、黃酮[6]、酚酸類[5-7]等成分，有抗炎、保肝和抗癌等療效[8-10]。三萜類化合物在自然界中廣泛分布，具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、調(diào)血脂[11-14]等活性，開(kāi)發(fā)前景良好。本研究以超聲波法提取圓齒野鴉椿果皮總?cè)疲庙憫?yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時(shí)在果皮總?cè)频挚鼓[瘤活性方面做了考察，為今后圓齒野鴉椿藥用資源開(kāi)發(fā)和利用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HERAcell 240i型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma)；UV-2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；BS-210S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；BC-W201型恒溫水浴鍋(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Millipore Synergy-UV超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)；101A-0型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱(上海陽(yáng)興試驗(yàn)儀器有限公司)；TGL-16C型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

RPMI 1640 培養(yǎng)液、DMEM從培養(yǎng)液、青鏈雙抗、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone 公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司，批號(hào)：MKBP6836V)；齊墩果酸(阿拉丁公司，批號(hào)：11354215)；香草醛、冰乙酸、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜及其余試劑均為分析純。

圓齒野鴉椿于2018年10月采自福建省邵武市天成巖，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)研究員鄒雙全鑒定為省沽油科野鴉椿屬圓齒野鴉椿EuscaphiskonishiiHayata，其果實(shí)曬干后分離果皮和種子，將果皮粉碎成粉，并過(guò)50目篩備用。

1.3 細(xì)胞株

肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 圓齒野鴉椿果皮總?cè)频奶崛?/h3>

稱取圓齒野鴉椿干粉1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，按不同的液料比和不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液混合后，加入超聲波容器中，以設(shè)定的功率提取相應(yīng)的時(shí)間，獲得不同條件下的圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛∫骸?/p>

2.2 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)條件設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，如液料比10∶1～60∶1、提取時(shí)間30～120 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～80%、超聲功率100～500 W分別進(jìn)行試驗(yàn)，考察上述因素對(duì)圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷实挠绊?。根?jù)中心組合原理，以四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 三萜含量測(cè)定

齊墩果酸經(jīng)過(guò)105 ℃干燥處理后，稱量20 mg，用無(wú)水乙醇溫?zé)崛芙獾?00 mL的燒杯中，冷卻至常溫，無(wú)水乙醇定容于100 mL量瓶。分別加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL齊墩果酸對(duì)照品溶液于6個(gè)試管，80 ℃水浴揮干，加0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1 mL高氯酸，60 ℃水浴反應(yīng)20 min，冰浴10 min后用10 mL冰乙酸稀釋，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度(A)值[14]，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.600 1X-0.017 2 (r=0.998 6)，X為齊墩果酸對(duì)照品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)，Y為A540 nm。

2.4 圓齒野鴉椿總?cè)频募兓?/h3>

果皮提取物濃縮后利用硅膠柱進(jìn)行分離純化，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮及三氯甲烷-甲醇進(jìn)行分離洗脫，以乙酸酐-濃硫酸(Liebermann-Burchard)試劑進(jìn)行檢測(cè)[15]，收集洗脫液進(jìn)行減壓濃縮和干燥。

2.5 圓齒野鴉椿果皮總?cè)瓶鼓[瘤活性測(cè)定

2.5.1細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549、HepG2、HCT-116和MCF-7細(xì)胞，A549和HepG2細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，HCT-116和MCF-7細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)液，上述2種培養(yǎng)基中均含有胎牛血清(體積分?jǐn)?shù)為10%)、青霉素(1×105IU·L-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.5.2MTT法測(cè)定藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50) 96孔板中每孔180 μL種5×103個(gè)細(xì)胞，設(shè)置果皮總?cè)撇煌o藥濃度，于37 ℃培養(yǎng)箱48 h后加20 μL的MTT，再培養(yǎng)4 h，加 DMSO溶解甲瓚，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)A值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)×100%

(1)

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1液料比對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?稱取1.0 g果皮粉末，分別按液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL·g-1加入60%乙醇溶液，在溫度50 ℃和超聲功率300 W的條件下，超聲提取1 h。如圖1 所示，總?cè)铺崛÷试谝毫媳葹?0∶1時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)液料比>30∶1時(shí)，提取率開(kāi)始下降，這可能與液料比引起細(xì)胞外滲透壓的變化有關(guān)。

圖1 液料比對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

3.1.2提取時(shí)間對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?稱取1.0 g果皮粉末，在超聲波功率300 W、液料比30∶1和提取溫度50 ℃的條件下，加入60%乙醇，超聲提取45、60、75、90、105、120 min。如圖2所示，提取時(shí)間為75 min時(shí)總?cè)铺崛÷首畲螅?5 min后總?cè)铺崛÷事杂邢陆担赡苁且驗(yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波會(huì)破壞三萜化合物結(jié)構(gòu)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間為75 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

3.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?稱取1.0 g果皮粉末，在液料比為30∶1、提取溫度為50 ℃和超聲波功率為300 W條件下，依次加入體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，超聲提取75 min。如圖3所示，圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷蕪囊掖俭w積分?jǐn)?shù)30%～60%時(shí)顯著上升，60%和70%的乙醇提取率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而80%乙醇提取率略有下降(P<0.05)，可能與圓齒野鴉椿果皮總?cè)频臉O性有關(guān)，同時(shí)基于溶劑成本考慮，選擇60%乙醇作為下一步圓齒野鴉椿果皮總?cè)频奶崛∪軇?/p>

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

3.1.4超聲波功率對(duì)總?cè)铺崛÷实挠绊?稱取1.0 g果皮粉末，在液料比為30∶1、提取溫度為50 ℃和提取溶液為60%乙醇的條件下，以250、300、350、400、450、500 W超聲波功率超聲提取75 min。如圖4所示，圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷蕪墓β蕿?50～350 W顯著上升，提取率在400 W時(shí)達(dá)到最高，>400 W提取率開(kāi)始下降，可能過(guò)大的功率會(huì)造成總?cè)平Y(jié)構(gòu)的改變。

圖4 超聲波功率對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷实挠绊?/p>

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果和分析

3.2.1回歸模型 擬合以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，結(jié)合中心組合設(shè)計(jì)原理，將液料比(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、超聲波功率(D)設(shè)為自變量，因變量(Y)為圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷?，用代碼-1、0、1來(lái)表示每個(gè)因素的3個(gè)水平(見(jiàn)表1)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷蕿轫憫?yīng)值，對(duì)各因素進(jìn)行線性模型擬合，得到多元二次回歸模型方程：Y=9.63+0.17A-0.097B-0.030C-0.053D-0.41AB-0.25AC+0.23AD+0.85BC+0.43BD-0.048CD-0.70A2-0.72B2-0.61C2-0.16D2(r=0.984 2)。通過(guò)二次模型及其回歸系數(shù)的方差分析來(lái)檢驗(yàn)該模型的有效性，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析

該模型P<0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.923 4>0.05，表明模型與實(shí)際擬合較好，可以用來(lái)預(yù)測(cè)果皮總?cè)铺崛÷什?yōu)化其提取工藝。由F值可得出各因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響力為液料比>提取時(shí)間>超聲波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

3.2.2響應(yīng)面工藝優(yōu)化分析 從A、B、C、D的交互作用響應(yīng)面的陡峭情況可以看出AB、AC、BC三者的相互作用對(duì)圓齒野鴉椿總?cè)铺崛÷示哂休^大影響(見(jiàn)圖5)。通過(guò)Design Expert V8.0.6分析圓齒野鴉椿果皮總?cè)谱罴压に嚄l件為液料比34.91∶1，提取時(shí)間為70.16 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為66.73%，超聲功率為378.10 W，該條件下總?cè)铺崛÷蔬_(dá)到9.63%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整，將液料比35∶1、提取時(shí)間70 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)67%和超聲功率為400 W確定為最佳工藝提取條件。進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后，得到圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷势骄禐?9.63±0.06)%，與理論值一致且重復(fù)性好，說(shuō)明此響應(yīng)面法得出的回歸模型較可靠。

圖5 兩因素相互作用對(duì)圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷实捻憫?yīng)面圖

3.3 圓齒野鴉椿果皮總?cè)频目鼓[瘤活性

果皮提取物濃縮后利用硅膠柱分離純化和濃縮干燥，得到圓齒野鴉椿果皮總?cè)?。用DMSO溶解總?cè)坪?，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度，分別處理HepG2、A549、HCT-116和MCF-7細(xì)胞48 h，MTT法測(cè)細(xì)胞存活率并作細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率圖，采用SPSS 22.0軟件求出圓齒野鴉椿果皮總?cè)频腎C50。結(jié)果表明，圓齒野鴉椿果皮總?cè)茖?duì)HepG2、A549、HCT-116和MCF-7均有明顯的增殖抑制作用，其IC50分別為(90.38±0.96)、(87.56±1.35)、(86.95±1.64)、(97.30±1.27)μg·mL-1，體現(xiàn)了良好的抗腫瘤活性，見(jiàn)圖6。

圖6 圓齒野鴉椿總?cè)茖?duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

4 討論

響應(yīng)面法結(jié)合多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值間的函數(shù)關(guān)系，建立多維空間曲面，通過(guò)評(píng)價(jià)生物影響因子及其交互作用得出最佳水平，這是高效的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法[15]。本實(shí)驗(yàn)以單因素考察為基礎(chǔ)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了總?cè)频奶崛」に?，并確定液料比35∶1、提取時(shí)間70 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)67%和超聲功率為400 W為最佳提取工藝條件，此條件下得到的理論提取物中總?cè)铺崛÷蕿?.63%，并進(jìn)行了3次驗(yàn)證，得到圓齒野鴉椿果皮總?cè)铺崛÷势骄禐?9.63±0.06)%，與理論值一致，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得出的提取工藝有一定參考價(jià)值。

惡性腫瘤極大地威脅了人類的健康，所以尋找有效治療抗腫瘤藥物是世界醫(yī)學(xué)研究面臨的重要課題。近年來(lái)，一些傳統(tǒng)的藥用植物在腫瘤預(yù)防和治療中顯示了良好的療效，這讓人們開(kāi)始去關(guān)注和了解[16]。三萜類在植物中普遍存在，有很強(qiáng)藥理活性，屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，可應(yīng)用在抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)和利用[17-19]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿果皮醇提物治療惡性腫瘤有一定效果[9]，但其中的抗腫瘤活性成分還未進(jìn)行進(jìn)一步的分析。本研究通過(guò)對(duì)圓齒野鴉椿果皮總?cè)七M(jìn)行制備和抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，其結(jié)果顯示，圓齒野鴉椿果皮總?cè)茖?duì)肝癌、肺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的增殖抑制活性，有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。