張彥斌 羅海濤 范鑫 王巖 鄭玉山 張宏博

（內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心 010090）

內(nèi)蒙古自治區(qū)境內(nèi)的草原是我國最大的草場和天然牧場，是國家重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地。其中綿羊是非常重要的畜牧養(yǎng)殖業(yè)組成部分，隨著社會發(fā)展與技術(shù)進(jìn)步，綿羊通過雜交繁育出很多不同的品種，以滿足人們對其乳、肉、皮毛等產(chǎn)品的不同需求，飼養(yǎng)和培育出蘇尼特羊、烏珠穆沁羊、察哈爾羊、呼倫貝爾羊、烏冉克羊、灘羊、巴美肉羊、昭烏達(dá)肉羊、杜泊羊、小尾寒羊、無角陶塞特羊、德克塞爾羊、澳洲白綿羊、德國肉用美利奴羊、蒙古羊等優(yōu)良品種[1,2]。錫林郭勒草原位于內(nèi)蒙古自治區(qū)東中部，是水草豐美的牧場，是華北地區(qū)重要的生態(tài)屏障，境內(nèi)有全國唯一被聯(lián)合國教科文組織納入國際生物圈監(jiān)測體系的錫林郭勒國家級草原自然保護(hù)區(qū)。錫林郭勒羊肉品質(zhì)譽(yù)滿天下，錫林郭勒的羊生長在一碧萬頃的草原牧場，以草原上的野生植物和優(yōu)質(zhì)牧草為食，飲用天然泉水，造就了 “烏珠穆沁羊”“蘇尼特羊”“察哈爾羊”等優(yōu)良品種，天然的環(huán)境造就了其肉質(zhì)純天然、無污染、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)成分富集的特點(diǎn)，具有稀特性和唯一性[3]。

隨著錫林郭勒羊地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品的成功申報，對擴(kuò)大“蘇尼特羊”“烏珠穆沁羊”“察哈爾羊”等品牌的知名度，提升產(chǎn)品附加值，提高經(jīng)濟(jì)效益、帶動地區(qū)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展、打擊假冒偽劣等方面將起到積極的推動作用[4]。隨著人民生活水平的提高，羊肉消費(fèi)逐漸火熱，使得不法商人看到內(nèi)蒙古草原羊肉的商機(jī)所在，于是以假亂真、以次充好來獲取暴利。由于高品質(zhì)羊肉的需求也越來越多，而不同品種的羊肉市場需求與銷售價格相差甚遠(yuǎn)，就需要對其品種與產(chǎn)地的進(jìn)行區(qū)分。

因地理標(biāo)志羊肉產(chǎn)品價格高銷路好，其他品種與產(chǎn)地的羊肉冒充地理標(biāo)志羊肉產(chǎn)品在市場上出現(xiàn)，為保護(hù)生產(chǎn)者、經(jīng)營者與消費(fèi)者的權(quán)益，確實做好地理產(chǎn)品，需對疑似肉類樣本進(jìn)行品種與產(chǎn)地上的雙重鑒定。產(chǎn)地的鑒定主要使用同位素標(biāo)記[5]進(jìn)行檢測，但品種間遺傳多樣性還沒有公認(rèn)可行的方法。

1 當(dāng)前綿羊品種遺傳多樣性研究概況

綿羊品種分化、遺傳多樣性研究，一般是從常染色體、母系遺傳標(biāo)記線粒體基因組、父系遺傳標(biāo)記Y 染色體等不同層面進(jìn)行。常染色體分析能直接反映生物種群或個體間基因組DNA的差異。相較于常染色體分析，線粒體基因組 (mt DNA) 是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小、進(jìn)化速度快、遺傳自主、無組織特異性，母系遺傳為主，現(xiàn)有研究表明存在父系遺傳現(xiàn)象[6]。在近緣種間和種內(nèi)群體間具有豐富的多態(tài)性，是探究動物群體遺傳多樣性和追蹤家養(yǎng)動物起源的載體。Y 染色體分子遺傳標(biāo)記一般是指Y 染色體上非重組區(qū)的標(biāo)記，具有遵循父系遺傳、不與X 染色體重組、突變率比mt DNA 低等特點(diǎn)，是進(jìn)化事件的忠實記錄者，可以反映父系對馴化哺乳動物基因池的貢獻(xiàn)[7]。由于分子標(biāo)記類型不同、綿羊種群不同、實驗數(shù)據(jù)處理方式不同等因素，使多數(shù)研究結(jié)果缺乏可比性；其次，部分品種的引種繁育[8]，綿羊品種研究證據(jù)不夠充分，使得綿羊品種的遺傳多樣性工作與群體遺傳結(jié)構(gòu)分析工作進(jìn)展較為緩慢。

2 綿羊品種遺傳多樣性方法與技術(shù)探索

基于對傳統(tǒng)研究方法受基因表達(dá)和環(huán)境共同影響，相比之下分子標(biāo)記可直接反映核酸水平的遺傳變異。分析方法都基于對同源序列的相似性分析，同源序列是指從某一共同祖先經(jīng)過趨異進(jìn)化而形成的不同序列，相似性是指序列比對過程中檢測序列和目標(biāo)序列之間相同堿基或氨基酸殘基序列所占比例的大小，是序列之間相關(guān)的一種量度，兩序列的相似性可以基于序列的一致性的百分比[9]。第一代分子標(biāo)記分析方法主要是限制性片段長度多態(tài)性 （RFLP） 分析；第二代分子標(biāo)記分析方法主要是微衛(wèi)星DAN 分析；第三代分子標(biāo)記分析方法主要是單核苷酸多態(tài)性 （SNP） 分析?，F(xiàn)有發(fā)表的文獻(xiàn)中，以錫林郭勒綿羊羊各品種為樣本進(jìn)行品種遺傳多樣性的研究成果較少，且對察哈爾羊進(jìn)行遺傳多樣性研究的文獻(xiàn)暫時未找到，所以需參照其他品種的研究成果來進(jìn)行論述。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性 （RFLP）

限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP) 標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA 標(biāo)記技術(shù)，基本原理是將染色體組DNA 用特定的限制性內(nèi)切酶識別并切割，產(chǎn)生很多長度不相同的核苷酸片段[10]，是研究動物群體間親緣關(guān)系及群體遺傳多樣性的有效途徑，已廣泛應(yīng)用于家畜起源進(jìn)化、親緣關(guān)系、畜禽群體的遺傳結(jié)構(gòu)及考察畜禽地方品種遺傳資源多樣性的研究中[11]。鞏元芳[12]等對9 個綿羊品種用RFLP 分為4 個單倍型，單倍型Ⅰ在品種間和品種內(nèi)均有分布，但比例不同；灘羊、小尾寒羊和烏珠穆沁羊以單倍型Ⅰ為主，但仍有其他單倍型。李祥龍[13]等采集9 個地方綿羊品種，對樣本的mt DNA 的 D-loop 區(qū)進(jìn)行 RFLP 分析，結(jié)果表明，湖羊、蒙古羊、烏珠穆沁羊的多數(shù)個體屬于單體型Ⅰ，且單體型Ⅰ和Ⅱ在品種間和品種內(nèi)均有分布。古麗格娜[14]對7 種綿羊和4 種山羊GDF9 基因G1 突變基因型進(jìn)行PCR-RFLP分析，檢測到兩種基因型，將11 種羊分為雜合型 （AB） 和純合型 （AA），其中內(nèi)蒙古絨山羊僅檢測到 AA 型，其余 10 個綿羊和山羊品種均檢測到AA、AB 兩種基因型。陳靜茹[15]等利用PCR-RFLP 技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定了食品中多趾北京油雞肉與華都艾拔益加肉雞是家禽品種鑒別的成功案例。

綜合分析RFLP 對綿羊品種區(qū)分的各個研究成果，RFLP 只能檢測到部分不同序列位點(diǎn)，且DNA 鏈的二級結(jié)構(gòu)還容易造成人工假象，使測序結(jié)果出現(xiàn)偏差，常出現(xiàn)劃分不清晰，無法區(qū)分或區(qū)分混亂的結(jié)果，需要更精細(xì)更清晰的品種遺傳多樣性分析方法。

2.2 微衛(wèi)星

微衛(wèi)星也稱簡單串聯(lián)重復(fù)序列，一般由2～6bp 組成核心序列，重復(fù) 10～20 次，首尾相接而組成。因其數(shù)量多、分布廣、保守性強(qiáng)的特性，是各類遺傳標(biāo)記方法中極有價值的方法之一，常用于畜牧種群分子水平上遺傳結(jié)構(gòu)的研究［16］。馬月輝等［17］對 12 個中國地方綿羊品種及一個外來品種，選取 30 個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，蘇尼特羊和烏珠穆沁羊首先聚為一類，灘羊和小尾寒羊聚為一類，然后這4 個品種作為一個分支聚為一類。郭小雅等［18］分析了我國 6 個綿羊山、羊品種的遺傳分化，進(jìn)一步證明了烏珠穆沁羊和小尾寒羊、灘羊、湖羊、同羊有較近的親緣關(guān)系，共同歸屬于 “蒙古羊”系。耿巖等［19］利用微衛(wèi)星法分析了中國蒙系 6 個綿羊品種，當(dāng)用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹時，灘羊和烏珠穆沁羊最先聚在一起，后與小尾寒羊聚為一類；當(dāng)用UPGMA 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹時，小尾寒羊與烏珠穆沁羊最先聚在一起，不同的分析統(tǒng)計方法得出不同的分析結(jié)果。仲濤等［20］采用 21 個微衛(wèi)星座位，運(yùn)用DA 遺傳距離將9 個地方綿羊品種進(jìn)行分類，其中屬于蒙古羊系的烏珠穆沁羊、呼倫貝爾羊、灘羊和湖羊聚為一類。侯冠彧［21］等利用 30 個 SSR 標(biāo)記，對 6 個綿羊品種共 237 個體進(jìn)行遺傳多樣性分析，系統(tǒng)發(fā)生樹將6 個綿羊品種劃為4 個分支，其中蘇尼特羊和烏珠穆沁羊為一支、內(nèi)蒙古細(xì)毛羊和小尾寒羊為一支；并進(jìn)一步對6 綿羊品種的NJ 法和UPGMA 法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，樹中烏珠穆沁羊和蘇尼特羊是蒙古羊分化最晚的2 只；由于2 個品種地理位置、氣候條件、飼養(yǎng)方式等都比較接近，受人文環(huán)境影響又很類似，加上有些類群長期的無目的雜交育種，最后導(dǎo)致2 個群體的同質(zhì)性增加，遺傳距離減小。陳李鵬［22］等對 6 個綿羊品種，用 6 個微衛(wèi)星座位對 280個個體進(jìn)行遺傳多樣性分析；計算了6 個綿羊品種間的多態(tài)信息含量、雜合度和遺傳距離，并進(jìn)行了主成分分析和UPGMA聚類；呼倫貝爾羊與烏珠穆沁羊遺傳距離最小，首先聚為一類，它們均來自內(nèi)蒙古，生活環(huán)境極為相似，均是在當(dāng)?shù)亻L期的自然和人工選擇情況下而逐漸育成的肉脂兼用型綿羊品種。

綜合分析各研究成果表明，蘇尼特羊、呼倫貝爾羊、烏珠穆沁羊、小尾寒羊等品種均隸屬于蒙古羊系統(tǒng)，起源于共同的祖先群體而親緣關(guān)系相對較近，許多研究也證實了這一觀點(diǎn)。因起源相近，受自然條件與人為因素的影響又極為類似，使得同質(zhì)性較高。在當(dāng)前微衛(wèi)星的研究中，其量化方法存在爭議，因數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法直接影響分析結(jié)果，需要用更準(zhǔn)確的分析統(tǒng)計方法來做進(jìn)一步的分析及討論。

2.3 單核苷酸多態(tài)性 (SNP)

全稱 Single Nucleotide Polymorphisms，指在基因組上單個核苷酸的變異 （包括置換、顛換、缺失和插入），形成遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量多，分布廣泛，多態(tài)性豐富，易于快速、規(guī)?；Y查，便于基因分型等特點(diǎn)，其作為新的遺傳標(biāo)記對基因定位及相關(guān)疾病研究的意義亦非常重大[23]。目前SNP 的檢測方法有很多，基于PCR 技術(shù)的RADP 法、AFLP 法和單鏈構(gòu)象多態(tài)性 （SSCP），直接測序的方法，基于雜交的方法及毛細(xì)管電泳法等[24]。趙倩君等[25]對8 個綿羊的線粒體D-loop 全序列進(jìn)行了測序分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將中國綿羊分為3 大支系，除南非肉用美利奴羊的7 綿羊群體在3 個支系中均有分布，而南非肉用美利奴羊僅在支系B 中檢測到品種間無明顯區(qū)分。鞏元芳等[26]利用RAPD 標(biāo)記分析10 個綿羊品種得出的遺傳多樣性，蒙古羊與湖羊首先聚一起，而后與烏珠穆沁羊聚為一類，表現(xiàn)出這幾種地方綿羊品種有較近的親緣關(guān)系，并與其所處的地理位置也表現(xiàn)一定的相關(guān)性。趙興波等[27]采用PCR-SSCP技術(shù)對7 個綿羊品種mt DNA 控制區(qū)5′端序列分析發(fā)現(xiàn)，可分為突變型和野生型，且不同品種綿羊在兩個類型中均有分布，不能作為品種的特征性差別。袁澤湖等[28]使用11 個綿羊品種的 SNP 芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用 PCA、NETVIEW、STRUCTURE、NJ 樹等方法對群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，PCA 分析能將地理起源的不同個體分開[29,30]其中烏珠穆沁羊與湖羊、同羊等聚為一類，NETVIEW 分析也印證了PCA 的結(jié)果，烏珠穆沁羊與哈薩克羊羅布羊有較近的親緣關(guān)系，STRUCTURE 分析烏珠穆沁羊與藏羊，二者無明顯分化，NJ 分析中，羅布羊和烏珠穆沁羊的遺傳分化系數(shù)最低。黃丹麗等[31]利用PCR-SSCP 技術(shù)檢測烏珠穆沁羊123 個樣本的FSHR 基因第10 外顯子的 SNP 發(fā)現(xiàn)，此綿羊FSHR 基因第10 外顯子序列與小尾寒羊的同源性分別為100%。劉月麗等[32]利用主成分分析 （PCA） 提取 SNP 主要位點(diǎn)，隨后使用隨機(jī)森林方法，對主位點(diǎn)的重要性進(jìn)行評估，訓(xùn)練分類模型。選取重要度排名前的位點(diǎn)，以這些位點(diǎn)為分類特征，建立分類模型進(jìn)行品種鑒別，減少了用于品種鑒別的SNP位點(diǎn)個數(shù)，降低了品種鑒別成本，為今后SNP 分析提供新的位點(diǎn)篩選方法。

目前，國內(nèi)在動物品種遺傳多樣性分析領(lǐng)域中對SNP 的研究處于快速發(fā)展階段，多數(shù)用于人體病變、動物育種、生理性狀等方面，在動物類研究中關(guān)于豬、雞方面的報道較多，而研究羊的較少，存在廣闊的發(fā)展空間。而SNP 在綿羊研究中，多數(shù)是針對性狀與育種方面。研究表明，部分基因的SNP 位點(diǎn)與個體的發(fā)育性狀有關(guān)，可以將此類基因作為選育生長發(fā)育性狀的分子遺傳標(biāo)記[33]。隨著育種與社會需求的增加，將加速SNP分子標(biāo)記技術(shù)在綿羊育種分子遺傳標(biāo)記在綿羊育種、遺傳分析中的應(yīng)用。

3 錫林郭勒綿羊品種遺傳多樣性分析展望

錫林郭勒綿羊在遺傳多態(tài)性和品種分化方面的研究仍比較薄弱，還沒有足夠的來自遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的信息，很難對錫林郭勒綿綿羊進(jìn)行更加深入、全面的分析和認(rèn)識。人工選擇、遷移、突變等生物技術(shù)的應(yīng)用不同程度地導(dǎo)致群體遺傳結(jié)構(gòu)的改變，這些均會給研究分析帶來影響。而不同研究方法，不同遺傳標(biāo)記、不同聚類方法會產(chǎn)生不同甚至相矛盾的結(jié)果，所以需開發(fā)新的新的研究方法或模型，整合各影響因素，使實驗結(jié)果趨于統(tǒng)一，分析研究更準(zhǔn)確完善。

在今后工作中建議從以下幾個方面開展研究：(1) 加大研究樣本的品種與數(shù)量，使各品種的研究分析結(jié)果具有代表性；(2) 盡量結(jié)合多種遺傳標(biāo)記與遺傳分析方法，增加研究的普遍性；(3) 利用先進(jìn)的測序技術(shù)對mt DNA、Y 染色體和常染色體進(jìn)行全面剖析，探索更便于分析研究的基因序列；(4) 開發(fā)較為完善的數(shù)據(jù)分析模型，使得數(shù)據(jù)分析更為準(zhǔn)確。