李 曼，陳少謀，魏小麗，邱孝萌

（1.安康市畜牧獸醫(yī)中心，陜西 安康 725000；2.白河縣畜牧獸醫(yī)中心，陜西 安康 725800）

非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus, ASFV）感染家豬和各種野豬（非洲野豬、歐洲野豬等）引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。2018年8月，遼寧省沈陽市確診我國首例非洲豬瘟，至今全國所有省份都已出現(xiàn)非洲豬瘟疫情，對我國生豬產(chǎn)業(yè)帶來重創(chuàng)。為降低非洲豬瘟擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)、切斷病毒傳播途徑、有效防范非洲豬瘟，保障生豬產(chǎn)品的有效供給和質(zhì)量安全，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求自2019年7月1日起，各屠宰場須自行開展非洲豬瘟檢測工作。從安康屠宰企業(yè)實(shí)施情況看，各屠宰企業(yè)均能夠按照要求購買熒光定量PCR儀和診斷試劑，配備檢測技術(shù)人員，能夠按照“批批檢、全覆蓋”的要求開展非洲豬瘟自檢，企業(yè)生物安全意識明顯增強(qiáng)。但由于屠宰場實(shí)驗(yàn)室檢測環(huán)境條件、儀器設(shè)備條件、實(shí)驗(yàn)室檢測人員等各方面條件參差不齊，在檢測過程中仍然發(fā)現(xiàn)一些問題。因此，規(guī)范開展非洲豬瘟熒光PCR檢測，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，是當(dāng)前工作中面臨的重要任務(wù)。

1 存在問題

1.1 樣品采集方式

按照要求，屠宰企業(yè)應(yīng)按照生豬不同來源實(shí)施分批屠宰，樣品采集可在入場前也可在入場后，但應(yīng)確保批批檢，頭頭檢。安康市各屠宰企業(yè)多選擇入場后從血池或血液儲存器具中采樣，此種采樣方法較進(jìn)場前采樣簡便、易于操作，不需要投入過多人力，但卻存在一旦檢出陽性樣品需停產(chǎn)消毒的風(fēng)險(xiǎn)。而且在實(shí)際操作中存在采集樣品數(shù)量不均、混合不充分、無法控制混樣比例的問題，影響檢測的準(zhǔn)確度，極易漏檢。

1.2 混樣比例問題

目前采用的熒光PCR方法的最低檢出量一般在10個(gè)病毒拷貝左右，按照要求同一張檢疫合格證需為同一來源，混樣比例不要超過1∶50，混樣比例越高，漏檢風(fēng)險(xiǎn)越大。在實(shí)際操作中我們也發(fā)現(xiàn)由于樣品采集過程中不能保證每份血清樣品等量混合，從而導(dǎo)致部分血清超過規(guī)定稀釋倍數(shù)，造成漏檢。還有部分屠宰企業(yè)為了節(jié)約檢測成本隨意提高混樣比例，極大地降低了檢測的準(zhǔn)確性。同時(shí)還存在部分待宰散戶僅有十幾只甚至幾只生豬，按要求采樣檢測成本較高，散戶難以承受等問題。

1.3 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境簡陋設(shè)施不完善

熒光PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，但對設(shè)施和環(huán)境要求也高，一般的PCR檢測室設(shè)置為配液、核酸提取、擴(kuò)增3個(gè)功能室，且需有緩沖間物理屏障、空氣流向等要求以防止核酸污染。目前，安康市大部分屠宰企業(yè)沒有進(jìn)行合理分區(qū)，甚至整個(gè)檢測過程混在一個(gè)區(qū)域進(jìn)行，極易造成實(shí)驗(yàn)室核酸污染。此外，實(shí)驗(yàn)室恒溫設(shè)備、超凈工作臺、生物安全柜、高壓滅菌器等設(shè)備不全，甚至有些實(shí)驗(yàn)室連基本的個(gè)人防護(hù)工具也沒有配備，既不能保障樣品及人員安全，也無法保障環(huán)境安全。

1.4 儀器設(shè)備和檢測試劑質(zhì)量參差不齊

目前市售的熒光PCR儀價(jià)格從幾萬到幾十萬元不等，檢測通道有2、3、4通道，種類五花八門。檢測試劑廠家繁多，質(zhì)量和靈敏度參差不齊。屠宰企業(yè)在選購熒光PCR儀和檢測試劑時(shí)更多的是考慮降低成本，而忽略了檢測精度和使用有效期等問題。有些儀器公司買儀器送試劑，但儀器只能使用配備的專用試劑，常常遇到檢測精度不足、通量不夠等問題。部分企業(yè)購買的檢測試劑中還存在試劑量不足、試劑保質(zhì)期臨期甚至過期等問題。

1.5 檢測人員專業(yè)水平有待提升

檢測人員是確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確的最核心要素。對安康市開展的屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測比對結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，即使是相同的儀器設(shè)備、相同的試劑耗材，相同的檢測樣品，檢測結(jié)果卻差異顯著。很多屠宰企業(yè)配備了專職檢驗(yàn)員，經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)后檢測準(zhǔn)確率較高，而個(gè)別屠宰企業(yè)臨時(shí)抱佛腳，僅僅經(jīng)過儀器設(shè)備廠家的簡單培訓(xùn)就上崗，操作不規(guī)范，檢測結(jié)果差異性大。

2 應(yīng)對措施

2.1 做好樣品采集和試劑管控

在樣品采樣過程中要避免交叉污染，保證采樣的均一性，不要超比例混樣。檢測樣品可以根據(jù)不同的對象和要求進(jìn)行混樣檢測。樣本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后要及時(shí)進(jìn)行分離和制備，盡快進(jìn)行檢測，如不能馬上進(jìn)行檢測要放置于-20 ℃保存。采購的非洲豬瘟病毒診斷用品應(yīng)當(dāng)取得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部核發(fā)的產(chǎn)品批準(zhǔn)文號，要嚴(yán)格按試劑盒的要求妥善保存試劑，避免使用偽劣、過期或失效試劑。

2.2 完善實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施

非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)進(jìn)行分區(qū)，合理劃分配液、核酸提取、擴(kuò)增3個(gè)獨(dú)立工作區(qū)域，從而形成單向流程的保護(hù)屏障，避免試驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對試驗(yàn)過程造成污染。實(shí)驗(yàn)室必須配備熒光PCR儀、低溫離心機(jī)、核酸提取儀、生物安全柜、冰箱、移液器等主要儀器設(shè)備，并嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行維護(hù)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運(yùn)行。

2.3 強(qiáng)化人員培訓(xùn)，實(shí)行專人專崗

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室必須配備具有畜牧獸醫(yī)專業(yè)相關(guān)學(xué)歷的專職檢測人員，經(jīng)專業(yè)的檢測技術(shù)、生物安全培訓(xùn)，獲得上崗資格后方可開展熒光PCR檢測工作。同時(shí)要制定并執(zhí)行定期考核和培訓(xùn)制度，定期參加實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)，以提升檢測人員的檢測技能。

2.4 有效規(guī)范開展檢測工作

采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的非洲豬瘟病毒診斷制品進(jìn)行檢測，不同廠家試劑盒其檢測方法略有不同，應(yīng)嚴(yán)格按說明書的要求操作。用于非洲豬瘟檢測的樣品，應(yīng)根據(jù)不同的要求做好留樣。檢測結(jié)果為疑似陽性的樣品應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢后仍為疑似或陽性的樣品應(yīng)及時(shí)報(bào)告當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)主管部門或動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)。如果需要留樣的，應(yīng)單獨(dú)保存，并在樣品復(fù)核和送檢完成后對樣品及時(shí)進(jìn)行無害化處理。熒光PCR試驗(yàn)完畢后，為避免病毒通過污染的用具、廢棄的物品進(jìn)行傳播，要做好人員和物品進(jìn)出的管控，檢測接觸的器械及時(shí)消毒，檢測后的廢棄物及時(shí)進(jìn)行無害化處理。

生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟自檢對于切斷非洲豬瘟傳播途徑、降低流通環(huán)節(jié)傳播風(fēng)險(xiǎn)意義重大。目前來看安康市屠宰企業(yè)自檢在實(shí)驗(yàn)室配備、檢測人員、試劑及耗材、規(guī)范操作等方面上還有待進(jìn)一步的改善和提高，屠宰企業(yè)應(yīng)該充分認(rèn)識，及早完善實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，建立相關(guān)管理體系，確保非洲豬瘟檢測工作順利準(zhǔn)確進(jìn)行。