趙世明 律鳳霞

摘 要：分離純化番茄早疫病致病真菌并提供病原純菌株.從牡丹江市郊區(qū)棚室栽培地采集疑似感染早疫病的番茄葉片進(jìn)行內(nèi)源病菌分離培養(yǎng)和生物學(xué)初篩純化和測序，8株菌有黑色素分泌且鏡檢到分生孢子，其中3株P(guān)CR產(chǎn)物序列相同，與網(wǎng)站公布的鏈格孢菌高度同源，確定獲得番茄早疫病病原純菌株.

關(guān)鍵詞：番茄早疫病;病原菌;分離純化;分子鑒定

[中圖分類號] ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Abstract：In order to isolate and purify the pathogenic fungi of tomato early blight，to provide pure strains of the pathogen，pure strains of the pathogen were obtained from tomato leaves suspected to be infected with early blight from different greenhouse cultivation sites in the suburbs of Mudanjiang.The results showed that 8 strains had melanin secretion and Conidia were detected by microscope，3 of them had the same PCR product sequence and high homology with Alternaria tenuissima published on the website，identified as obtain the pure pathogen of tomato early blight.

Key words：tomato early blight;pathogen;isolation and purification;molecular identification

番茄，茄科番茄屬，一年生或多年生草本植物，其果實營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，可生食，也可加工食用，是三大世界性貿(mào)易蔬菜之一.我國番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，番茄生產(chǎn)位居全球第一，是我國經(jīng)濟(jì)收入較高的重要蔬菜品種之一.[1-2]番茄栽培除露地栽培外，更多的是棚室栽培.番茄病害發(fā)生是影響栽培產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)的主要原因.番茄早疫?。═omato Early Blight）就是番茄栽培中重要病害之一.番茄早疫病又稱為“輪紋病”，該病菌寄主范圍廣泛，發(fā)病時主要危害葉片、莖和果實.[3]病原菌以分生孢子或菌絲體隨病殘體遺落土中越冬，春天番茄種植后以分生孢子借氣流傳播蔓延、初侵染和再侵染，屬多循環(huán)病害.結(jié)果盛期發(fā)病嚴(yán)重，重茬地、瘠薄地或通風(fēng)不良栽培地發(fā)病較重，農(nóng)民經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重.[4-5]植物病原菌的分離純化不僅是植物病害診斷的主要依據(jù)，也是栽培過程中綜合防治及抗性育種的病原基礎(chǔ).[6]筆者分離純化了牡丹江市郊區(qū)農(nóng)田的番茄早疫病致病真菌，經(jīng)微生物形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)驗證，確認(rèn)其是引起病害的病原菌種屬，為番茄栽培中病害診斷防控及抗病育種提供病原純菌株.

1 材料與儀器

試驗材料 牡丹江市郊區(qū)農(nóng)田番茄栽培地采集的早疫病癥狀的番茄葉片.

試驗儀器 PCR試劑盒（寶生物工程有限公司產(chǎn)品），真菌DNA提取試劑盒（QIAGEN公司產(chǎn)品），瓊脂糖（Sigma 公司產(chǎn)品）.

2 試驗方法

病原物初培養(yǎng)后轉(zhuǎn)板純化 超凈工作臺內(nèi)選擇帶有明顯病害癥狀、病健交界清晰的番茄病葉，1.5‰升汞浸泡7 min，無菌水多次清洗，無菌剪刀剪取病健交界組織約1 cm2，平擺至PDA培養(yǎng)皿中.封口膜封邊，25 ℃恒溫倒置暗培養(yǎng)，每個調(diào)查點做一個平板.當(dāng)病組織邊緣有內(nèi)寄生菌生長時，無菌環(huán)境下挑取菌落外緣菌絲，兩點接種轉(zhuǎn)板至新PDA培養(yǎng)基，多次轉(zhuǎn)板直至菌落單一，達(dá)到純化目的.

純化的單菌落色素分泌及分生孢子辨析 純培養(yǎng)早疫病菌的菌絲初期灰白色，后期有黑色素分泌.以黑色素分泌為條件，初篩培養(yǎng)物，繼續(xù)培養(yǎng)至菌落呈全黑色.無菌解剖刀刮挑菌落表面物，制玻片，顯微鏡下觀察病菌形成的分生孢子器和散落的分生孢子形態(tài).[7]

單菌落病菌的DNA分子鑒定 呈全黑色的初培養(yǎng)菌落繼續(xù)培養(yǎng)至有較厚菌膜形成，刮取菌膜經(jīng)液氮速凍后試劑盒提取菌絲DNA[8-10]，以真菌ITS通識引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITs4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系見表1.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，有大于500 bp特異帶的PCR產(chǎn)物送去測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站BLAST比對.[11-13]

純化病原菌的保存 經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對驗證病原菌純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接至試管PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌絲長滿試管，放4 ℃冰箱暫時保存.

3 結(jié)果與分析

3.1 田間番茄病葉早疫病癥狀初鑒別

高溫高濕是早疫病發(fā)生的主要環(huán)境因子之一，因此，前期采集病樣選擇棚室番茄栽培地調(diào)查，患病番茄葉片初期為散布的褐色小斑點，逐

漸擴展為同心輪紋褐斑.病斑區(qū)域略凹陷，病斑邊緣有黃綠色暈環(huán)，濕度大時病斑連片且表面有明顯的黑粉物.見圖1.

3.2 病原菌分離純化及生物學(xué)特性初篩鑒定

升汞表面消毒后的病葉組織接種到PDA培養(yǎng)基上，每24 h觀察一次內(nèi)源病菌的萌發(fā)情況，剔除有雜菌污染的培養(yǎng)皿，見圖2.一周左右病葉邊緣有明顯菌絲萌發(fā)，病原菌萌發(fā)初期菌絲為淺白色，菌落中心灰黑色.

3.3 純培養(yǎng)物色素分泌及分生孢子形態(tài)分辯

為了更好的辨識病原菌的微生物形態(tài)，需要培養(yǎng)病菌的單菌落.當(dāng)病葉邊緣有明顯菌落形成時，分別對應(yīng)轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)恒溫暗培養(yǎng).多次轉(zhuǎn)板至形成純單菌落，見圖3.轉(zhuǎn)板初期菌絲白色，病菌繼續(xù)生長菌落直徑增加，菌落中心灰黑色至純黑色.培養(yǎng)2周后，菌落長滿培養(yǎng)皿呈全黑色，見圖3、圖4，符合早疫病菌黑色素分泌的微生物學(xué)特征.