姜鳳全 王琪 曹勝吉

摘要：目的 ?探討XT-4000i血細胞分析儀體液模式下對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)中應用的可行性。方法 ?于2018年7～10月收集我院神經(jīng)內(nèi)科患者腦脊液標本46例。用XT-4000i血細胞分析儀體液模式對收集的腦脊液標本白細胞計數(shù)及分類計數(shù)的精密度、攜帶污染率、線性范圍等進行性能驗證評估，并將儀器法和手工計數(shù)法的白細胞計數(shù)及分類結(jié)果進行比較。結(jié)果 ?腦脊液白細胞總數(shù)計數(shù)精密度低、中、高值變異系數(shù)分別為1.92%、1.60%、1.45%;單個核細胞計數(shù)低、中、高值變異系數(shù)分別為4.31%、2.63%、2.73%;多形核細胞計數(shù)低、中、高值變異系數(shù)分別為3.00%、0.09%、1.59%。白細胞總數(shù)計數(shù)、單個核細胞計數(shù)、多形核細胞計數(shù)攜帶污染率分別為 0.07%、0.64%、0.29%。腦脊液樣本中，白細胞檢測范圍（0～10.06）×109/L，單個核細胞檢測范圍為（0～2.459）×109/L，多形核細胞檢測范圍為（0～7.60）×109/L，線性均良好。腦脊液白細胞計數(shù)及分類儀器法與人工法相關性良好，兩種方法對白細胞計數(shù)及分類的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 ?應用XT-4000i血細胞分析儀體液模式下的白細胞計數(shù)及分類精密度良好，攜帶污染率低，線性良好，與人工鏡檢法相關性良好，可用于人工鏡檢應用于腦脊液白細胞計數(shù)及分類。

關鍵詞：XT-4000i血細胞分析儀;腦脊液;白細胞計數(shù);分類計數(shù)

中圖分類號：R446.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.21.024

文章編號：1006-1959（2020）21-0082-05

Abstract：Objective ?To explore the feasibility of the application of XT-4000i blood cell analyzer in cerebrospinal fluid white blood cell counting and classification counting in body fluid mode.Methods ?From July to October 2018， 46 samples of cerebrospinal fluid from the Department of Neurology of our hospital were collected. Use the body fluid mode of the XT-4000i blood cell analyzer to verify the performance of the collected cerebrospinal fluid samples for the white blood cell count and the classification count precision， carry contamination rate， linear range， etc.， and perform the white blood cell count and classification results of the instrument method and manual counting method compare.Results ?The cerebrospinal fluid white blood cell count had low， medium， and high value coefficients of variation of 1.92%， 1.60%， and 1.45%， respectively; low， medium， and high value of mononuclear cell counts had coefficients of variation of 4.31%， 2.63%， and 2.73%; polymorphism the coefficients of variation of low， medium and high nuclear cell counts were 3.00%， 0.09%， and 1.59%， respectively. The total number of leukocyte count， mononuclear cell count， and polymorphonuclear cell count carry contamination rates of 0.07%， 0.64%， and 0.29%， respectively. In the cerebrospinal fluid samples， the detection range of white blood cells was （0-10.06）×109/L， the detection range of mononuclear cells was （0-2.459）×109/L， and the detection range of polymorphonuclear cells was（0-7.60）×109/L， with good linearity. The cerebrospinal fluid white blood cell count and classification instrument method had a good correlation with the manual method. The two methods had no statistically significant difference in the white blood cell count and classification （P>0.05）.Conclusion ?The white blood cell count and classification under the body fluid mode of the XT-4000i blood cell analyzer had good precision， low contamination rate， good linearity， and good correlation with manual microscopy. It could be used for manual microscopy for cerebrospinal fluid white blood cell counting and classification.

Key words：XT-4000i blood cell analyzer;Cerebrospinal fluid;White blood cell count;Classification count

傳統(tǒng)的腦脊液白細胞分類計數(shù)為手工顯微鏡法，由檢驗科技術人員操作，操作人員專業(yè)水平要求較高，操作時間較長[1]。SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀在腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)中使用流式細胞術原理和電阻抗原理，腦脊液白細胞經(jīng)過染色后進入流動室，細胞由激光束照射，經(jīng)過折射散射等，產(chǎn)生前向散射光，側(cè)向散射光以及側(cè)向散射熒光，由光電倍增管和光電二極管吸收，吸收的光信號經(jīng)過系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻毎畔⒌碾娦盘?，極大的提高了檢測效率，且不需要離心，操作簡便，已經(jīng)在臨床工作中被廣泛應用。本研究使用用腦脊液標本驗證XT-4000i血細胞分析儀在體液模式下的精密度，攜帶污染率，線性范圍及與人工鏡檢結(jié)果的比對分析，確定其性能參數(shù)，探討 XT-4000i血細胞分析儀體液模式對腦脊液白細胞計數(shù)及分類的可行性分析。

1材料與方法

1.1儀器與試劑 ?日本Sysmex XT-4000i血細胞分析儀及XT-4000i配套試劑（日本Sysmex）;光學顯微鏡（ 日本Olympus 公司）;Neubauers 血細胞計數(shù)板;冰醋酸;天青、伊紅染液。

1.2研究對象 ?收集2018年7～10月大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者腦脊液標本46例，患者年齡31～67歲，其中男30例，女16例;臨床診斷為細菌性感染：化膿性腦膜炎29例，結(jié)核性腦膜炎2例;真菌性感染：隱球菌性腦膜炎1例;病毒性感染：病毒性腦膜炎6例;蛛網(wǎng)膜下腔出血8例，所有的腦脊液標本的檢測均在采集完成后2 h以內(nèi)完成。

1.3實驗方法

1.3.1儀器質(zhì)控 ?分析前對機器進行質(zhì)控，確定機器在控，沖洗機器使機器本底低于2個細胞/μl。

1.3.2精密度分析 ?參考NCCLS EP15-A相關說明，取白細胞計數(shù)低值、中值、高值三個不同水平的新鮮腦脊液，應用體液模式下的SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀對腦脊液白細胞及分類連續(xù)重復計數(shù)11次，去掉第1次測量結(jié)果，計算平均值、標準差及變異系數(shù)。根據(jù)儀器說明書，變異系數(shù)低值參考標準要求在5%以內(nèi)，中值和高值要求在3%以內(nèi)。

1.3.3攜帶污染率試驗 ?根據(jù)CLIS-H56-A的 《體液細胞分析儀評價指南》對攜帶污染率進行測定，取白細胞計數(shù)較高的腦脊液標本，將標本混勻，使用XT-4000i重復測定3次，3次測量結(jié)果記為H1、H2、H3;取白細胞計數(shù)較低值腦脊液標本，將標本混勻后重復測定3次，三次測量結(jié)果依次記為L1、L2、L3。攜帶污染率=（L1-L3）/（H3-L3）×100%，參照儀器使用規(guī)范說明書，儀器攜帶污染率要求在1%以內(nèi)。

1.3.4可報告范圍試驗 ?選取接近預期上限的高值腦脊液標本（H），分別按100%、80%、60%、40%、20%、10%、0的比例進行稀釋，每個稀釋度標本連續(xù)測定3次，計算3次測量均值。驗證儀器線性范圍，儀器實測值偏離應小于理論值10%，計算 y=ax+b，線性良好要求a值在1±0.05范圍以內(nèi)，r≥0.975。對白細胞計數(shù)進行線性驗證，同時對測定范圍內(nèi)的單個核細胞計數(shù)、多形核細胞計數(shù)進行線性驗證。

1.3.5比對試驗 ?從入組的46例腦脊液標本中選取40例，其中白細胞總數(shù)計數(shù)≤0.5×109/L標本20例，白細胞計數(shù)>0.5×109/L標本20例，使白細胞數(shù)盡量分布于整個線性范圍。將每份標本分為3等份，一份在體液模式下應用XT-4000i血細胞分析儀進行分析，重復測量2次;第2份用于人工白細胞總數(shù)計數(shù)，計數(shù)人員為兩名副高職以上，5年以上細胞形態(tài)學工作經(jīng)驗的檢驗人員，腦脊液參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》人工鏡檢計數(shù)，連續(xù)計數(shù)兩次，操作步驟為取1支干凈試管，沿管壁滴加1滴冰醋酸，濕潤管壁，滴加5滴混勻的腦脊液，將試管放置10 min，充分破壞紅細胞，將標本沖入計數(shù)板，計數(shù);第3份腦脊液標本離心后取沉渣涂片，使用天青、伊紅染液染色后進行白細胞分類計數(shù)。標本應在采集后2 h內(nèi)完成，計算儀器檢測與手工鏡檢計數(shù)之間的差異。

1.4統(tǒng)計學處理 ?使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，鏡檢與手工法的相關分析用Pearson檢驗，差異用U檢驗，以P>0.05為差異無統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果與分析

2.1精密度驗證 ?在白細胞計數(shù)為低值、中值、高值的腦脊液標本中，白細胞計數(shù)及分類計數(shù)經(jīng)過反復測定，計算出反應精密度的變異系數(shù)，腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)精密度測定結(jié)果見表1。精密度的變異系數(shù)均在要求的機器說明書檢測判定標準以內(nèi)，證明體液模式下，應用SYSMEX ?XT-4000i血細胞分析儀對腦脊液標本檢測重復性較好。

2.2攜帶污染率實驗 ?根據(jù)CLIS-H56-A的《體液細胞分析儀評價指南》攜帶污染率低于1%為合格，檢測結(jié)果見表2。實驗中檢測得白細胞計數(shù)及分類計數(shù)攜帶污染率均低于標準1.00%，即儀器體液模式下對腦脊液的攜帶污染率符合要求。

2.3臨床可報告范圍 ? 取高值腦脊液標本，按實驗方法中對可報告范圍的要求操作，計算均值，確定儀器臨床線性可報告范圍。白細胞計數(shù)及分類計數(shù)臨床可報告范圍見圖1～圖3。

在體液模式下應用SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀，對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)中，不同稀釋度測量值線性關系a值和相關系數(shù)r均符合要求，線性良好，腦脊液白細胞計數(shù)可報告范圍是（0～10.06）×109/L，單個核細胞計數(shù)可報告范圍是（0～2.459）×109/L，多形核細胞計數(shù)可報告范圍是（0～7.6）×109/L。

2.4準確性分析

2.4.1白細胞計數(shù)及分類計數(shù)儀器法與人工法一致性分析 ?本研究對40例腦脊液標本進行了儀器檢測法與人工鏡檢法的白細胞計數(shù)與分類計數(shù)。一致性結(jié)果分析統(tǒng)計見表3及圖4～圖7。白細胞總數(shù)計數(shù)及分類計數(shù)使用手工法及儀器法，R2≥0.95，說明儀器法與人工鏡檢計數(shù)法一致性良好。

2.4.2腦脊液白細胞總數(shù)計數(shù)及分類計數(shù)比較 ?在腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)中，人工鏡檢法與儀器檢測法對細胞計數(shù)的檢測比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。證明SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀在體液模式下對腦脊液中白細胞計數(shù)及分類計數(shù)與人工鏡檢相關良好，結(jié)果準確，見表4。

3討論

實驗室體液檢查多依賴人工鏡檢，費時費力，對人員技術要求較高，重復性較差，室內(nèi)質(zhì)控難以正常進行，近年來，有學者推薦使用血常規(guī)分析儀和尿常規(guī)分析儀對體液標本聯(lián)合檢查方法，但該方法并未收錄到臨床操作規(guī)程當中。流式細胞術作為一種興起的迅速進行細胞分類與分選技術，在XT-4000i血細胞分析儀中得到應用，依據(jù)電阻抗原理將細胞定量、吸樣至指定稀釋比，經(jīng)過染液染色，染色后的樣本流入流動池中，進入流動池的激光束照射到樣本細胞上，由于光的反射、折射，產(chǎn)生前向散射光、側(cè)向散射光、側(cè)向散射熒光等，前者由光電二極管吸收，反應細胞的體積大小，后兩者由光電倍增管接收，反應細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及染色信息，最后光信號轉(zhuǎn)化為可被電腦系統(tǒng)識別的電脈沖，得到細胞種類及計數(shù)。這些特點使SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀的計數(shù)能夠較準確。 同時，流式細胞術廣泛應用于細胞分選，根據(jù)細胞表面的粘附分子，粘附分子表達差異可能決定了細胞的遷移，也是細胞分選的重要依據(jù)[2]。

在精密度分析中，由實驗數(shù)據(jù)可知，在低值測量結(jié)果中，白細胞計數(shù)、單個核細胞計數(shù)及多形核細胞計數(shù)的變異系數(shù)分別為1.92%、4.31%、3.00%，均低于機器傳統(tǒng)要求計數(shù)CV值的判定標準5%，即對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)的CV值滿足儀器測定的標準與韓媛等報道的結(jié)果相似[3]，證明在檢脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)低值中，XT-4000i血細胞分析儀測定結(jié)果良好，機器精密度良好。在中值測量結(jié)果中，白細胞計數(shù)、單個核細胞計數(shù)及多形核細胞計數(shù)的變異系數(shù)分別為1.60%、2.63%、0.09%，均低于機器傳統(tǒng)要求計數(shù)CV值的判定標準3%，即對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)的CV值滿足儀器測定的標準，證明在檢脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)中值時，XT-4000i血細胞分析儀檢測定結(jié)果良好，機器精密度良好。在高值測量結(jié)果中，白細胞計數(shù)、單個核細胞計數(shù)及多形核細胞計數(shù)的變異系數(shù)分別為1.45%、2.73%、1.59%，均小于機器要求的判定標準3%，即對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)的CV值滿足儀器測定的標準，證明檢脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)高值時，XT-4000i血細胞分析儀檢測定結(jié)果良好，機器精密度良好。

在攜帶污染率實驗中，檢測得白細胞計數(shù)計數(shù)攜帶污染率為0.07%、單個核細胞計數(shù)計數(shù)攜帶污染率為0.64%、多形核細胞計數(shù)攜帶污染率為0.29%，均低于機器參考標準1.00%，可知XT-4000i血細胞分析儀體液模式下，腦脊液標本計數(shù)及分類計數(shù)受攜帶污染影響小，參考值準確。對白細胞、單個核細胞及多形核細胞計數(shù)，稀釋度為100%、80%、60%、40%、20%、10%、0，測量值線性關系a值和相關系數(shù)r均在參考標準范圍內(nèi)，白細胞檢測值上限為10.60×109/L，單個核細胞檢測上限為2.459×109 /L，多形核細胞檢測上限為7.60×109/L，SYSMEX XT-4000i血細胞分析儀在體液模式下對腦脊液白細胞計數(shù)及分類計數(shù)，檢測范圍較寬，線性結(jié)果良好。對腦脊液人工鏡檢與在體液模式下使用XT-4000i對白細胞計數(shù)及分類計數(shù)，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），證明在體液模式下應用XT-4000i血細胞分析儀對白細胞計數(shù)及分類計數(shù)與作為金標準的人工鏡檢法差異不大。

腦嵴液由臨床醫(yī)師進行腰椎穿刺采集，必要時也可由小腦延髓池或者側(cè)腦室穿刺采集，穿刺成功后首先需要進行壓力測試。實驗室接收腦嵴液的標準：①檢驗申請單中應包含患者先關信息，包括患者姓名、性別、年齡、住院號、病歷號、標本類型，申請項目，標本采集時間，還應對患者的臨床診斷及相關的用藥情況進行備注說明;②檢驗申請單所包含的內(nèi)容應與標本標注內(nèi)容應相一致;③標本量達到檢測標準。實驗室應對如下腦嵴液選擇拒收：①標本標注內(nèi)容與實驗申請單內(nèi)容不一致拒收;②腦嵴液常規(guī)及生化檢查標本超過兩個小時拒收;③腦嵴液常規(guī)標本量不低于0.5 ml，其他項目不低于1 ml，否則拒收。腦嵴液標本的保存：腦嵴液標本采集后需要立即送檢，不能送檢的標本需2～4 ℃保存，時間不能超4 h。久置的腦嵴液標本會造成細胞形態(tài)改變，并可能由于纖維蛋白的存在而致細胞異常分布，影響檢查結(jié)果，葡萄糖也會降解致含量偏低。合格的腦脊液標本應滿足：3份腦脊液標本收集容器標識清楚、采集量滿足檢驗項目需求。

由于統(tǒng)計方法受限，且腦脊液白細胞數(shù)量較少，本次使用SYSMEX XT-4000i僅對白細胞進行了計數(shù)及分類計數(shù)，多形核細胞檢測主要是腦脊液中中性粒細胞，單個核細胞檢測主要淋巴細胞，未對腦脊液中紅細胞、單核細胞、其他粒細胞計數(shù)。正常腦脊液無色透明，不凝集，腦脊液循環(huán)過程中細胞與外界的交換有賴于血腦屏障的通透性及細胞表面所攜帶的粘附分子[3]，有學者認為腦脊液的吸收主要發(fā)生在循環(huán)過程中，由CNS完成[4]，正常成人腦脊液白細胞（0～8）×106/L，正常兒童腦脊液白細胞計數(shù)（0～15）×106/L，白細胞主要為淋巴細胞或者單核細胞，不同疾病腦脊液白細胞種類不同，如化膿性腦膜炎腦脊液白細胞增多表現(xiàn)為中性粒細胞增多，增高的淋巴細胞為CD3+CD4+T 細胞，結(jié)核性腦膜炎早期腦脊液中中性粒細胞顯著增高，晚期則以淋巴細胞增高[5]，多發(fā)性硬化患者增高的淋巴細胞主要為CD4+細胞。