于秀菊 孫錚 韓小濤 李鈺鈺

摘 要：為了開發(fā)豬用微生態(tài)制劑，本試驗(yàn)對前期從呂梁黑豬腸道中篩選到的1株抑菌活性較強(qiáng)的菌株P(guān)B-2進(jìn)行活化、抑菌活性檢測、菌落形態(tài)觀察和16S rDNA同源序列分析。結(jié)果顯示分離純化到的菌株P(guān)B-2對李斯特菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌具有顯著的抑菌效果，菌株鑒定表明PB-2為地衣芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：抑菌活性;地衣芽孢桿菌;16S rDNA

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等有益芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑。芽孢桿菌（Bacillus sp.）是一類好氧型或兼性厭氧型革蘭氏陽性菌，是動植物微生態(tài)的優(yōu)勢菌之一，不僅種類繁多，而且來源廣泛，在土壤、水體、空氣及動物腸道中都存在[1-2]。芽孢桿菌也是抑菌物質(zhì)的生產(chǎn)者，其產(chǎn)生的細(xì)菌素是繼乳酸菌細(xì)菌素之后的又一類主要的細(xì)菌素，與乳酸菌研究最多的Nisin相比，該類細(xì)菌素在耐受性方面表現(xiàn)突出[3]，已作為益生菌廣泛應(yīng)用于食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥和生物農(nóng)藥等領(lǐng)域。研究數(shù)據(jù)顯示，在過去的5年中，研究人員從多種樣品中篩選出有益芽孢桿菌，并分離純化出新的細(xì)菌素。有益芽孢桿菌的開發(fā)和應(yīng)用可能是解決抗生素問題的一個有效方案。

1 ?菌株

菌株P(guān)B-2為筆者所在研究小組在前期試驗(yàn)中從呂梁黑豬腸道中分離純化得到的。大腸桿菌、沙門菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和藤黃微球菌保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)所用下層板為2%瓊脂。上層板用的是含有107 CFU/mL指示菌的0.75% TSA培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g，大豆蛋白胨5 g，氯化鈉30 g，瓊脂7.5 g，水1 000 mL）或15 mL 0.75%的BHI（腦心浸液）培養(yǎng)基，待上層凝固后，將一定間隔放置的牛津杯拔出，形成上層板。

2 ?方法

2.1 菌株的活化和抑菌活性檢測

將-80 ℃保存的PB-2甘油菌活化后，按照1∶100的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，10 000 g，4 ℃下離心20 min，收集上清液，用0.22 μm濾器過濾獲得無細(xì)胞的培養(yǎng)上清。運(yùn)用牛津杯法檢測其抑菌活性[4]。

2.2 PB-2菌株的鑒定

菌落形態(tài)：將菌株P(guān)B-2劃線接種于LB平板上，培養(yǎng)12 h，觀察單菌落的形態(tài)特征。

革蘭氏染色：參考革蘭氏染色試劑盒的說明書進(jìn)行革蘭氏染色，在Leica DMIRB 顯微鏡油鏡下觀察PB-2的形態(tài)。

16S rDNA法鑒定：以提取的菌體DNA作為模板，采用16S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上下游引物序列分別為：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。運(yùn)用NCBI的BLAST進(jìn)行比對，分析分離菌的同源性，鑒定其菌種歸屬。

3 ?結(jié)果

3.1 菌株P(guān)B-2的抑菌活性

菌株P(guān)B-2的發(fā)酵上清對革蘭氏陽性菌具有明顯的抑菌活性（表1）。

3.2 菌株P(guān)B-2的鑒定

PB-2菌落呈白色略帶黃色，菌落邊緣不整齊，表面不光滑且不透明，形成“黏液狀的花形”菌落形態(tài)（圖1A）;經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下觀察可見菌株P(guān)B-2呈紫色短桿狀，細(xì)胞單個或成對存在（圖1B）;PB-2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 400 bp，瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1C;將PB-2 16S rRNA測序結(jié)果與NCBI的BLAST進(jìn)行比對，結(jié)果顯示該菌株與Bacillus licheniformis 16S rRNA基因序列相似度高達(dá)99%。

4 ?討論

自然界蘊(yùn)藏著豐富的可維持菌群平衡的益生菌資源[5]。本文對從呂梁黑豬腸道中分離的一株細(xì)菌PB-2進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌具有明顯的抑菌活性，通過細(xì)菌染色和形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定為芽孢桿菌。根據(jù)文獻(xiàn)報道，16S rDNA序列同源性大于99%，可以認(rèn)為屬于同一種;同源性為95%～98%可以認(rèn)為是同屬不同種;同源性在95%以下可以認(rèn)為屬于不同屬。本文根據(jù)菌株P(guān)B-2的16S rDNA鑒定結(jié)果確定該菌株為地衣芽孢桿菌。

瓊脂擴(kuò)散方法是分離和篩選具有拮抗作用微生物的最經(jīng)典的方法[6]，在分離和篩選動物、植物和環(huán)境來源的拮抗微生物方面得到了普遍的應(yīng)用。Ren等利用該方法從發(fā)酵乳中分離到具有拮抗作用的乳酸菌[7];Ge等運(yùn)用瓊脂擴(kuò)散方法從泡菜中分離到副干酪乳桿菌，并從該菌中純化得到新型細(xì)菌素HD1-7[8]。本試驗(yàn)采用這種方法，對分離到的PB-2進(jìn)行抑菌活性測定，結(jié)果表明該菌株對金黃色葡萄球菌、李斯特菌具有抑制效果。

參考文獻(xiàn)：

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[7] Ren D， Zhu J， Gong S， et al. Antimicrobial Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolated from Homemade Fermented Foods[J]. Biomed Res Int， 2018， 2018： 5416725.

[8] Ge J， Sun Y， Xin L， et al. Purification and Partial Characterization of a Novel Bacteriocin Synthesized by Lactobacillus paracasei HD1-7 Isolated from Chinese Sauerkraut Juice[J]. Sci Rep， 2016， 14（6）： 19366.