范盈盈，王富蘭，王 帥，陳 賀，劉峰娟，胡東強，武愛波，王 成

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究所，烏魯木齊 830091； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(烏魯木齊)/新疆農(nóng)產(chǎn)品質量安全重點實驗室，烏魯木齊 830091； 3.中國科學院 營養(yǎng)代謝與食品安全重點實驗室，中國科學院 上海營養(yǎng)與健康研究所，中國科學院 上海生命科學研究院，中國科學院大學，上海 200031；4.新疆農(nóng)業(yè)科學院 科研管理處，烏魯木齊 830091)

紅棗是新疆林果業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一，也是新疆最具資源優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Φ氖称樊a(chǎn)業(yè)。自2010年以來，黑斑病已成為危害新疆紅棗最大的病害，造成年平均產(chǎn)量損失超過30%，嚴重時超過60%。某些年份因出現(xiàn)暴雨、冰雹等極端天氣，引發(fā)黑斑病爆發(fā)，大片棗園基本絕收。

大量植物病理學研究[1-2]已證明引起紅棗黑斑病的主要病原菌為鏈格孢屬真菌，如鏈格孢菌(Alternariaalternata)、細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)等。鏈格孢屬真菌具有寄生、腐生特點，可在田間、運輸和儲藏過程中侵染植物引起霉變，甚至在低溫環(huán)境下也能侵染、生長，它是導致水果、蔬菜等部分冰箱儲存食品腐敗變質的主要微生物[3-4]。鏈格孢屬真菌可產(chǎn)生70多種鏈格孢毒素[5-6]，包括鏈格孢酚(alternariol,AOH)、鏈格孢酚甲基醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交鏈孢霉烯(altenuene,ALT)、騰毒素(tentoxin,TEN)、細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)等。該類毒素具有致畸、致突變作用[7-10]，人類食管癌高發(fā)病率可能與之密切相關[11]。筆者課題組采用自建的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法[12]分析了14種紅棗樣品中的鏈格孢毒素，發(fā)現(xiàn)TeA、AOH、AME和TEN 在所有黑斑病紅棗中都有檢出，其中TeA的檢出率最高。

目前，僅有中國學者對紅棗黑斑病有研究，且多集中在黑斑病的危害分布[13-14]、病原菌鑒定[15-16]、發(fā)生規(guī)律[17-18]以及防控[19-20]等方面，對病原菌的生理學特性、尤其是產(chǎn)毒特性鮮見系統(tǒng)研究。本試驗利用‘駿棗’黑斑病果實中分離、純化得到的10株鏈格孢屬真菌，進行其生理學特性方面的研究，測定所產(chǎn)毒素的種類及含量，以期找到優(yōu)勢產(chǎn)毒菌，用于后續(xù)其產(chǎn)毒條件和影響因素研究，為紅棗黑斑病的防治及鏈格孢毒素的防控奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 根據(jù)前期病原菌的分離鑒定結果，選取5株鏈格孢菌(A.alternata，編號為：JZAa01～JZAa05)和5株細極鏈格孢菌(A.tenuissima，編號為：JZAt01～ JZAt05)用于生物學特性研究。

1.1.2 試驗材料 PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂14.0 g，加水補足 1 000 mL；察氏(Czapek)固體培養(yǎng)基：KCl 0.5 g，蔗糖30.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41.0 g，NaNO33.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂 15.0 g，加水補足1 000 mL；紅棗固體培養(yǎng)基：紅棗粉200 g，瓊脂15.0 g，加水補足1 000 mL。

鏈格孢酚(AOH)、鏈格孢酚甲基醚(AME)、細交鏈孢菌酮酸(TeA)、騰毒素(TEN)、交鏈孢霉烯(ALT)、鏈格孢毒素(ATX-I)等20種常見真菌毒素標準品(奧地利Romer公司)；乙腈、甲酸(LC-MS級)(美國Fisher公司)；亮氨酸腦啡肽、IMS校準液(美國Waters公司)；屈臣氏純凈水。

1.1.3 儀器設備 超高效液相色譜-高分辨質譜(Vion IMS QTof MS)(美國Waters公司)、Nikon ECLIPSE E200顯微鏡(日本尼康儀器有限公司)。

1.1.4 毒素檢測條件 色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動相體系為含φ=0.1%甲酸的水(A)和含φ=0.1%甲酸的乙腈(B)，梯度洗脫程序0～2.5 min，5%的A升到80%，2.5～ 4.5 min，80%的A升到90%，4.5～6 min，90%的A保持不動，6～7 min，90%的含A降到5%；進樣量為5 μL；流速為0.3 mL/min。

高分辨質譜條件：全離子掃描模式，毛細管電壓為3.0 kV；去溶劑化溫度為350 ℃,源溫度為125 ℃,去溶劑化氣流為800 L/h,錐孔氣流為50 L/h,碰撞氣體為氬氣，壓力為4×10-3mbar。通過自建數(shù)據(jù)庫進行定性分析。

自建數(shù)據(jù)庫含有常見的20種真菌毒素：黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、AOH、AME、TEN、ALT、TeA、ATX-I、嘔吐毒素(DON)、恩鐮孢毒素A(Enn A)、恩鐮孢毒素B(Enn B)、伏馬毒素B1(FB1)、棒曲霉毒素(PAT)、HT-2毒素、T-2毒素、白僵菌素(BEA)、玉米赤酶烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株生長速率 將10株供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用5 mm打孔器取邊緣菌苔分別接種于PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和紅棗培養(yǎng)基上(直徑均為9 cm)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、4、5、6、7、10 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，重復3次。

1.2.2 產(chǎn)孢量 將10株供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用5 mm打孔器取邊緣菌苔分別接種于PDA培養(yǎng)基和紅棗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，無菌水洗下孢子，用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量，重復3次。

1.2.3 孢子萌發(fā)率 制備濃度為104個/mL各供試菌株孢子懸浮液，分別取50 μL涂布于察氏培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗放置6 h，在40倍顯微鏡下計數(shù)視野中萌發(fā)和未萌發(fā)的孢子數(shù)，其中以芽管長度>孢子半徑或1/2長軸長度的孢子計為萌發(fā)孢子，計算孢子萌發(fā)率，每視野觀察的孢子數(shù)>300個，每處理重復3次，試驗結果以百分數(shù)表示。

1.2.4 菌苔致病力 將活化后的各供試菌株轉接于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，用滅菌打孔器取菌落邊緣直徑5 mm的菌苔，針刺法接種到已用φ=75%酒精消毒過的健康脆熟期駿棗上，25 ℃保濕培養(yǎng)3 d后，測量病斑的直徑，比較各菌株菌苔的致病力差異。

1.2.5 毒素產(chǎn)生種類及含量 將活化后的10株供試菌株，分別接種到紅棗培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，用打孔器分別取5 mm菌餅置于離心管中，向其中加入1 mL乙酸乙酯(含φ=1%甲酸)，震蕩1 h，4 000 r/min離心5 min。將上清液轉入一個新離心管中，放于通風櫥內待溶劑揮干，向離心管中加入500 μL甲醇再次溶解，過0.22 μm有機濾膜，濾液經(jīng)超高效液相色譜-高分辨質譜儀進行毒素篩查分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，用Duncan’s 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基的種類比較

分別將10株供試菌株接種到察氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和紅棗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結果(圖1和圖2)發(fā)現(xiàn)10株菌株在紅棗培養(yǎng)基上生長速度略高于PDA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基高于察氏培養(yǎng)基，在第3天時，10株供試菌株在紅棗培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長的平均直徑差別不大，隨后在紅棗培養(yǎng)基上的平均生長速度開始加快，直到第7天后，開始逐漸長滿整個培養(yǎng)基；而10株供試菌株在PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上的平均生長速度均較低，且速率基本保持一致。這3種培養(yǎng)基的區(qū)別在于碳源和氮源，PDA培養(yǎng)基的碳源和氮源分別為馬鈴薯中的淀粉、葡萄糖和蛋白質、氨基酸，察氏培養(yǎng)基的碳源和氮源分別為蔗糖和NaNO3，紅棗培養(yǎng)基的碳源和氮源分別為紅棗中的多糖和蛋白質、氨基酸。由此可知，鏈格孢屬真菌更傾向于生長在含有機營養(yǎng)物的培養(yǎng)基上。

A.JZAa05/察氏培養(yǎng)基；B.JZAa05/紅棗培養(yǎng)基；C.JZAa05/PDA培養(yǎng)基；D.JZAt03/察氏培養(yǎng)基；E.JZAt03/紅棗培養(yǎng)基；F.JZAt03/PDA培養(yǎng)基

圖2 10株供試菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時間后的平均直徑Fig.2 Average diameters of 10 test strains cultured on different mediums of different days

2.2 不同菌株的平均生長速率比較

分別將10株供試菌株接種到紅棗培養(yǎng)基上，于第3、4、5、6、7、10天后測量菌落直徑，計算3～10 d內的平均生長速率(圖3)，發(fā)現(xiàn)JZAa01～JZAa05菌株的平均生長速率都保持在0.6 cm/d以上，而且?guī)缀醪淮嬖陲@著性差異，而JZAt01～JZAt05菌株的平均生長速率均低于0.5 cm/d，說明A.alternata比A.tenuissima更適于在紅棗培養(yǎng)基上生長。

2.3 不同菌株產(chǎn)孢量比較

分別將10株供試菌株接種到紅棗培養(yǎng)基上(圖4)，25 ℃下培養(yǎng)7 d后，用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量，發(fā)現(xiàn)JZAa05菌株的產(chǎn)孢量最高，達到1.8×107個/mL，JZAt01菌株的產(chǎn)孢量最低，為1.0×107個/mL；而且從圖4可以看出，JZAa01～JZAa05菌株的平均產(chǎn)孢量普遍略高于JZAt01～JZAt05菌株，這與不同菌株在紅棗培養(yǎng)基上的平均生長速度的結果相一致，進一步驗證了A.alternata比A.tenuissima更適于在紅棗培養(yǎng)基上生長。

2.4 不同菌株孢子萌發(fā)率比較

將相同濃度的各菌株的孢子懸浮液涂布于察氏培養(yǎng)基上，6 h后觀察孢子萌發(fā)情況，通過比較不同菌株孢子的萌發(fā)率發(fā)現(xiàn)(圖5)，JZAa05、JZAt03和JZAt04菌株的平均孢子萌發(fā)率均超過80%，其中JZAt03的最高。說明這3株菌株的生存活力較強。

圖柱上不同字母代表具有顯著性差異(P<0.05)。下同

圖4 不同菌株在紅棗培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的平均產(chǎn)孢量Fig.4 Aaverage amounts of spores production of different strains cultured in red jujube medium after 7 days

圖5 不同菌株的平均孢子萌發(fā)率Fig.5 Average spore germination rates of different strains

2.5 不同菌株的菌苔致病力比較

將相同大小的各菌株菌苔分別用針刺法接種到健康的脆熟期駿棗上，常溫常濕下隔離放置3 d后，發(fā)現(xiàn)10株菌株均能使健康青棗染病，其中JZAa05菌株在‘駿棗’上的致病直徑達到5 cm，且接種面均變黑、腐爛，JZAa01菌株能使駿棗表面有小面積病斑(圖6)。通過比較病斑直徑發(fā)現(xiàn)，JZAa05菌株的致病力最強，JZAa01 和JZAa03菌株的致病力最弱。

2.6 不同菌株的產(chǎn)毒種類及含量比較

將10株供試菌株分別接種到紅棗培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，溶劑法提取菌餅，用超高效液相色譜-高分辨質譜檢測產(chǎn)生的毒素種類，發(fā)現(xiàn)(圖7～8、表1～2)不同菌株在2種培養(yǎng)基上除了產(chǎn)生大量的鏈格孢毒素外，還產(chǎn)生少量的恩鐮孢毒素和HT-2毒素。2種培養(yǎng)基所產(chǎn)生種類最多的均為TeA，分別達到82.30 μg/kg(紅棗培養(yǎng)基)和128.90 μg/kg(PDA培養(yǎng)基)。同時PDA培養(yǎng)基上也產(chǎn)生了較多的AOH(0.06～ 24.96 μg/kg)、AME(0.16～36.55 μg/kg)和ALT(0～41.90 μg/kg)，其含量普遍高于紅棗培養(yǎng)基上同種毒素的含量。從菌株種類來看，A.alternata比A.tenuissima更適于在紅棗培養(yǎng)基上產(chǎn)生更多的毒素。在紅棗培養(yǎng)基上的優(yōu)勢產(chǎn)毒菌為JZAa02，JZAa03次之；而在PDA培養(yǎng)基上的優(yōu)勢產(chǎn)毒菌為JZAa03，JZAa02次之。

圖6 不同菌株對健康駿棗的致病力Fig.6 Average diameters of black spot resulted from different strains inoculated onto health Jun jujubes

圖7 不同菌株在紅棗培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)毒種類和含量Fig.7 Types and contents of toxins produced by different strains cultured on red jujube medium after 7 days

3 結論與討論

鏈格孢屬真菌種類繁多，適應能力強，大多數(shù)寄生在植物上，可引起多種蔬菜、水果、糧食等作物病害。目前，眾多學者針對從不同植物寄主，如紅棗[16]、玉米[21]、番茄[22]、樹莓[23]等病害樣品上分離得到的鏈格孢屬真菌都做了生物學特性研究，涉及到的特性參數(shù)主要有培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、pH、光照、碳源、氮源等，這些前人研究得到的最優(yōu)參數(shù)范圍針對不同種類的鏈格孢屬真菌沒有太大區(qū)別，故在本研究中，直接設定培養(yǎng)溫度為25 ℃，碳源、氮源及pH以所選的培養(yǎng)基為準，未做額外的調整。本研究在相同的培養(yǎng)條件下，主要探究不同種類的鏈格孢屬真菌(A.alternata和A.tenuissima)在不同培養(yǎng)基上的生長速率、產(chǎn)孢量、產(chǎn)毒種類及含量等方面的差異，研究結果發(fā)現(xiàn)：(1)相比較PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基，10株鏈格孢屬真菌在紅棗培養(yǎng)基上的生長速度最快，表現(xiàn)一定的寄主特異性，此研究結果與鄭肖蘭等[21]的研究類似；(2)在紅棗培養(yǎng)基上，A.alternata比A.tenuissima的生長速度更快，說明鏈格孢菌是紅棗黑斑病的優(yōu)勢病原菌，這與董寧等[15]、郭東起等[24]的研究結果一致，與宋博等[2]的研究結果不一致，可能與黑斑病棗采集時病害發(fā)展進程、病害發(fā)生區(qū)域等有關；(3)A.alternata和A.tenuissima在PDA培養(yǎng)基上比在紅棗培養(yǎng)基上能產(chǎn)生更多種類、更高含量的真菌毒素，這與從病棗中直接檢測到的毒素種類和含量高低結果一致[12,25]；(4)在相同的培養(yǎng)基上，A.alternata比A.tenuissima產(chǎn)生的毒素含量更高，尤以JZAa02和JZAa03最甚，更進一步說明了A.alternata為優(yōu)勢菌株。

表1 不同菌株在紅棗培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)毒含量Table 1 Contents of toxins produced by different strains cultured on red jujube medium after 7 days μg/kg

圖8 不同菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)毒種類和含量Fig.8 Types and contents of toxins-production of different strains cultured on PDA medium after 7 days

表2 不同菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的產(chǎn)毒含量Table 2 Contents of toxins produced by different strains cultured on PDA medium after 7 days μg/kg

綜上所述，鏈格孢屬真菌是引起紅棗黑斑病的主要致病菌，其種類較多，但是大部分的優(yōu)勢產(chǎn)毒菌為A.alternata，該菌的生存活力強，在不同的培養(yǎng)基上生長速度有差異，且產(chǎn)生的毒素種類和含量也不盡相同。綜合考慮產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和致病力，JZAa05為優(yōu)勢菌株。通過本試驗選出的優(yōu)勢產(chǎn)毒菌株，將用于后期系統(tǒng)探究其產(chǎn)毒條件及影響因素，進而得出新疆紅棗中鏈格孢毒素的產(chǎn)生規(guī)律。