杜 之，黃 鵬

(1.南昌大學(xué)a.第二臨床醫(yī)學(xué)院2018級； b.公共衛(wèi)生學(xué)院循證醫(yī)學(xué)中心；2.江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006)

冠狀病毒屬于套氏病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是一種有包膜的正股單鏈RNA病毒，其基因組由一個(gè)約30 kb的正義單鏈RNA組成，這是已知RNA病毒中最大的非分段基因組[1]。在此次新冠肺炎疫情之前，已知有六種冠狀病毒可以感染人類[2]，其中四種(HCoV-NL63、-229E、-OC43和-HKU1)可以引起輕度呼吸道感染，另外兩種SARS-CoV和MERS-CoV可導(dǎo)致嚴(yán)重的病毒性肺炎[3]。SARS-CoV-2是第七種人感染冠狀病毒，其與SARS和MERS都屬于β屬的冠狀病毒[4-5]。目前SARS-CoV-2導(dǎo)致的疫情還在全球不斷蔓延，研究其結(jié)構(gòu)以及與SARS-CoV的異同，有助于更好地了解其致病機(jī)制，尋找治療的靶點(diǎn)?；诖?，本文擬對SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與SARS-CoV的差異作一綜述，以期為該病毒的進(jìn)一步研究和防治提供線索或思路。

1 SARS-CoV-2的結(jié)構(gòu)

1.1 基因組結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2具有典型的冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)[6]，其單鏈RNA基因組大小為29 891個(gè)核苷酸，編碼9860個(gè)氨基酸，G+C含量為38%[7]。它具有14個(gè)編碼27種蛋白質(zhì)的開放閱讀框(ORF)，而位于基因組5′端的ORF1ab和ORF1a基因分別編碼pp1ab和pp1a蛋白，它們(ORF1ab和ORF1a基因)一起編碼15個(gè)nsp(非結(jié)構(gòu)蛋白)，包括nsp1至nsp10和nsp12至nsp16。其中編碼nsp1、nsp3和nsp15的基因相較于其他基因有著更高的突變率，這有助于病毒適應(yīng)并感染人類[8]。基因組的3′端包含4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白-刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、核衣殼蛋白(N)和N膜蛋白(M)，8個(gè)輔助蛋白(3a，3b，p6、7a，7b，8b，9b和orf14)[9]。盡管ORF區(qū)域的總體變異率較低，但ORF 8中的nt28144位點(diǎn)和ORF 1a中的nt8782位點(diǎn)的突變率分別高達(dá)30.53%和29.47%，提示SARS-CoV-2中可能存在選擇性突變[10]。

此外在開放閱讀框的5′端上游可以識別出一個(gè)先導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(TRS)和9個(gè)推測的TRS，這些推測的TRS核心序列以ACGAAC和CUAAAC兩種形式出現(xiàn)[11]。密碼子的有效數(shù)量可以用作密碼子使用偏好的度量，與SARS、bat SARS和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2有著較低的密碼子有效數(shù)量(尤其是在S蛋白、E蛋白和主要蛋白酶編碼基因中)，表明SARS-CoV-2具有更高的基因表達(dá)效率[12]。YANG等[13]通過對8組590個(gè)冠狀病毒完整基因組的編碼序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV和SARS-CoV-2中的人類慢密碼子和慢雙密碼子的總比例較低，提示SARS-CoV和SARS-CoV-2的蛋白合成率可能高于其他感染人類的冠狀病毒。

1.2 基因序列特點(diǎn)

作為典型的RNA病毒，SARS-CoV-2的平均進(jìn)化率約為每年每個(gè)位點(diǎn)10-4個(gè)核苷酸[14]。陳嘉源等[15]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2所在的β屬冠狀病毒B亞群存在大量的可變翻譯，從分子水平揭示了此類冠狀病毒變異快、多樣性高的特點(diǎn)。之前的研究[16]表明，SARS-CoV-2冠狀病毒的各個(gè)基因組之間具有高度序列相似性，有2個(gè)核心位置具有高度變異性，一個(gè)在ORF1ab基因座中，是一種沉默變異；另一個(gè)是氨基ORF8中的氨基酸多態(tài)性。不過最近的一項(xiàng)對103個(gè)SARS-CoV-2全基因組分子進(jìn)化分析表明[17]，SARS-CoV-2已經(jīng)演化出L和S 2個(gè)亞型，2個(gè)亞型的區(qū)別在于病毒RNA基因組的第28144位點(diǎn)，L亞型是T堿基(對應(yīng)亮氨酸，Leu)，S亞型是C堿基(對應(yīng)絲氨酸，Ser)。其中S亞型相對更古老，L亞型可能更具侵略性以及擴(kuò)散得更快速。

經(jīng)過基因組測序和比對，SARS-CoV-2的基因組序列與兩種蝙蝠源性SARS樣冠狀病毒、蝙蝠-SL-CoVZC45和蝙蝠-SL-CoVZXC21相關(guān)度較高，但與SARS-CoV(約79%)和MERS-CoV(約50%)較遠(yuǎn)[18]。ZHANG等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，穿山甲冠狀病毒是SARS-CoV-2的第二近親，此外還有研究[20]表明，蛇也可能是SARS-CoV-2的基因庫來源。

1.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2的外殼是冠狀病毒家族中最堅(jiān)硬的[21]，這給予了其更強(qiáng)的體外生存能力。多聚蛋白1ab(polyprotein 1ab，pp1ab)是冠狀病毒的最大蛋白，該蛋白通過蛋白水解切割成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并負(fù)責(zé)多蛋白的切割[22]。通過對SARS-CoV-2的pp1ab中的氨基酸特征分析有助于闡明其進(jìn)化起源。有研究[23]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的pp1ab與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的pp1ab相似度大于其與從中國穿山甲分離得到的冠狀病毒上的pp1ab的相似度，從而降低了SARS-CoV-2是直接從穿山甲進(jìn)化而來的可能性。此外，SARS-CoV-2和蝙蝠冠狀病毒RaTG13之間ORF1ab、N、S蛋白的氨基酸同源性分別高達(dá)98.55%、99.05%和97.41%，這些結(jié)果也表明這兩種病毒具有高度的遺傳關(guān)系[24]。此外FAHMI[25]等通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白，特別是nsp7b和nsp8對SARS-CoV-2及其密切相關(guān)的物種具有特異性，這可以為研究SARS-CoV-2提供新的見解。

與其他冠狀病毒相似，SARS-CoV-2外膜上的刺突糖蛋白以其糖基化而聞名[26]。所有冠狀病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞均由刺突糖蛋白介導(dǎo)，刺突糖蛋白通過在其表面形成刺突而使冠狀病毒呈冠狀外觀。刺突糖蛋白的氨基酸序列由1個(gè)大的胞外域、1個(gè)單次跨膜錨和1個(gè)短的C端胞內(nèi)尾部組成[27]。不同的冠狀病毒使用S1亞基內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)域來識別各種附著和進(jìn)入受體，如地方性人類冠狀病毒OC43和HKU1通過其S1的NTD連接至宿主細(xì)胞表面糖蛋白和糖脂上的5-N-乙酰基-9-O-乙?；僖核彳?；MERS-CoV使用S1上的NTD來識別非乙?；僖很崭街荏w[28]，SARS-CoV則是使用S1亞基的RBD來識別受體[29]。而SARS-CoV-2的刺突糖蛋白胞外域包含受體結(jié)合單元S1和膜融合單元S2。電子顯微鏡成像顯示，刺突糖蛋白形成了1個(gè)丁香狀的刺突，具有3個(gè)S1頭和1個(gè)三聚體S2莖。為了使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，S1通過其受體結(jié)合域(RBD)與特定的細(xì)胞表面受體結(jié)合，而S2融合宿主細(xì)胞和病毒膜，從而使病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞[30]。S蛋白上七肽重復(fù)序列1(HR1)和七肽重復(fù)序列2(HR2)可以相互作用形成六螺旋束(6-HB)，從而使病毒和細(xì)胞膜緊密融合[31]。此外，SARS-CoV-2蛋白上的受體結(jié)合模體(RBM)中的幾個(gè)關(guān)鍵殘基(尤其是Gln493)提供了與人受體ACE2分子良好的相互作用[32]。

目前大多數(shù)正在開發(fā)的疫苗均針對冠狀病毒的S蛋白[33]，主要是因?yàn)镾蛋白是中和抗體的重要誘導(dǎo)劑[34]。SARS-CoV-2的刺突蛋白具有多種人類蛋白質(zhì)群中缺乏的寡肽[35]，這些免疫學(xué)相關(guān)性的寡肽引起的免疫反應(yīng)將對冠狀病毒產(chǎn)生中和作用。這可能有助于尋找藥物作用SARS-CoV-2的靶點(diǎn)。COUTARD等[36]在SARS-CoV-2的刺突蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特的弗林蛋白酶樣切割位點(diǎn)，其位于S1/S2位點(diǎn)的N端，這是其他SARS樣冠狀病毒中所沒有的。弗林蛋白酶介導(dǎo)的感染機(jī)制與鼠肝炎冠狀病毒、HIV、埃博拉病毒和一些禽流感病毒的感染機(jī)制更相似；另外一些禽流感病毒也可以通過自然突變獲得1個(gè)Furin蛋白酶切位點(diǎn)[26]。此前的一項(xiàng)研究[37]表明，如果在SARS冠狀病毒S蛋白R667或R797位點(diǎn)人為地加入Furin酶切位點(diǎn)，可以增強(qiáng)S蛋白的膜融合能力。弗林蛋白酶樣切割位點(diǎn)可能對病毒的生命周期和致病性具有影響，國內(nèi)也有學(xué)者[38]提出弗林蛋白酶樣切割位點(diǎn)突變有可能增強(qiáng)了2019-nCoV侵染細(xì)胞的效率，進(jìn)而使其傳播力顯著大于SARS冠狀病毒，因此針對這種弗林蛋白酶樣酶的抑制劑可能有助于抑制病毒的傳播。最近美國的一項(xiàng)研究[39]提出，可以利用CRISPR/Cas13d系統(tǒng)，干擾復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物基因表達(dá)位點(diǎn)(ORF1ab)和刺突蛋白(S)的表達(dá)，從而抑制病毒的復(fù)制和結(jié)合功能。還有研究[7]發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的刺突蛋白S2亞基是高度保守的而且和人類SARS-CoV的S2亞基具有99%的同一性。因此，針對S2的廣譜抗病毒肽將是進(jìn)行臨床試驗(yàn)之前在動(dòng)物模型中值得測試的預(yù)防或治療方式[40]。

2 SARS-CoV-2與SARS-CoV的結(jié)構(gòu)差異

SARS-CoV-2的S蛋白的三維結(jié)構(gòu)類似于SARS病毒的S蛋白的三維結(jié)構(gòu)[41]，兩者的基因組序列在核苷酸水平上也具有極高的同源性[42]。但是兩者之間也存在一定的差異區(qū)域，研究這些差異區(qū)域有助于提供新的分子標(biāo)記，也有助于開發(fā)抗SARS-CoV-2的新藥。

2.1 結(jié)構(gòu)蛋白及其編碼基因的差異

SARS-CoV-2和SARS-CoV一樣，都使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)作為侵入細(xì)胞的受體[43]，但是兩者結(jié)合受體的S蛋白結(jié)構(gòu)卻有所不同。SARS-CoV S1亞基由2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：N末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)，這些結(jié)構(gòu)域都涉及到與宿主受體結(jié)合的能力[44]。CHAN等[45]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2的RBD核心結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與SARS相關(guān)冠狀病毒上的相同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列約有68%的相同部分，而SARS-CoV-2的S蛋白的S1亞基NTD的氨基酸序列與SARS-CoV上相同部位的氨基酸序列大約有66%的相同部分，此外兩者S1亞基RBD的外部亞結(jié)構(gòu)域區(qū)域的蛋白質(zhì)序列僅具有39%的同一性。此前的研究[20,29]表明SARS冠狀病毒的RBD中與ACE2受體的相互作用的關(guān)鍵氨基酸為Y442、L472、N479、D480、487和Y491，而JUNWEN等[46]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2上對應(yīng)的氨基酸變化為L455、F486、Q493、S494、N501和Y505。冠狀病毒的S1亞基，特別是S1亞基上的RBD，可以確定細(xì)胞嗜性、宿主范圍和冠狀病毒的人畜共患傳輸臨界[47-48]。所以S1亞基氨基酸序列的改變可能影響人類受體的選擇并因此影響該病毒的生物學(xué)行為。

另外，WRAPP等[41]測試了SARS-CoV的RBD定向單克隆抗體mAb(S230，M396和80R)與SARS-CoV-2的RBD的交叉反應(yīng)性，結(jié)果證明在測試濃度下三種mAb中的任何一種都未檢測到與SARS-CoV-2的RBD的結(jié)合。與之相反的是，有研究[49]報(bào)告SARS-CoV特異性人類單克隆抗體CR3022可以與SARS-CoV-2的RBD有效結(jié)合。綜合兩者的研究結(jié)果，SARS-CoV和SARS-CoV-2的RBD差異性顯著影響了中和抗體的交叉反應(yīng)性，因此開發(fā)可以特異性結(jié)合SARS-CoV-2的RBD的新型單克隆抗體可能是非常有必要的。

作為冠狀病毒中最豐富的蛋白質(zhì)，核衣殼蛋白(N)在冠狀病毒中是高度保守的[50]。N蛋白是病毒組裝中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒轉(zhuǎn)錄和組裝效率中起著關(guān)鍵作用。N蛋白也是干擾素(IFN)和病毒編碼抑制RNA干擾的拮抗劑，這可能有利于病毒復(fù)制[51]。BENVENUTO等[52]的研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白之間出現(xiàn)的多個(gè)氨基酸差異，這可以解釋為什么SARS-CoV-2的致病性低于SARS-CoV。

2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白及其編碼基因差異

ANGELETTIE等[53]對SARS-CoV-2的開放閱讀框1ab(ORF1ab)進(jìn)行了分析，研究結(jié)果證實(shí)SARS-CoV-2的氨基酸位置501(nsp2蛋白的321位)、723(nsp3蛋白中的543位)和1010(nsp3蛋白的192位)比SARS-CoV和Bat-SARS樣冠狀病毒有所改變，這可能是SARS-CoV-2比SARSS-CoV更具傳染力的原因之一。ORF8是在β冠狀病毒譜系B冠狀病毒中發(fā)現(xiàn)的輔助蛋白，從早期患者中分離出的人類SARS-CoV、所有貍類SARS-CoV和其他與蝙蝠SARS相關(guān)的CoV均含有全長ORF8[54]。SARS-CoV基因組開放閱讀框8(ORF8)中29nt核苷酸缺失，導(dǎo)致全長的ORF8的分裂為ORF8a和ORF8b[55]，這是其在人類中出現(xiàn)期間最明顯的基因變化。這些29 nt核苷酸的缺失導(dǎo)致減毒突變以及病毒復(fù)制水平的降低，可能與疫情消退有關(guān)[56]。目前SARS-CoV-2的基因組序列顯示ORF8完好無損[57]，這一情況值得學(xué)術(shù)界繼續(xù)關(guān)注。

綜上所述，SARS-CoV-2具有與SARS冠狀病毒類似的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，兩者都作用于ACE2受體，但是兩者S蛋白的RBD存在較大的差異，并顯著影響其侵染細(xì)胞的效率。針對這些差異區(qū)域進(jìn)行研究有助于研發(fā)靶向藥物，例如特異性結(jié)合SARS-CoV-2的RBD的新型單克隆抗體。此外，SARS-CoV-2的突變率高、進(jìn)化快，不利于研發(fā)疫苗和追蹤進(jìn)化來源及傳播的中間宿主。當(dāng)前，SARS-CoV-2導(dǎo)致的肺炎疫情仍在全球不斷蔓延，臨床上尚無特異藥物，疫苗研發(fā)也有待時(shí)日。尤其重要的是，SARS-CoV-2是否會發(fā)生變異，是否會具有更高傳播性和致病性，這些情況均不可預(yù)測，尚需學(xué)術(shù)界不斷研究和探索。