玉海玲

（廣西南寧市第四人民醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

艾滋?。ˋIDS）又稱為獲得性免疫缺陷綜合征，是因為人感染了人類免疫缺陷病毒（HIV）所致，嚴重危害人類身體健康。檢測HIV以利于盡早發(fā)現(xiàn)疾病，及時給予有效干預治療，切斷傳播路徑。自1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，艾滋病已從一種不可治愈的傳染性和致死性極高的疾病發(fā)展成可以控制的慢性傳染性疾病。

1 HIV抗體檢測

一般情況下被病毒侵入2-12周，就會出現(xiàn)HIV抗體，從感染HIV病毒到血清中能檢測出HIV抗體這段時間稱之為窗口期[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，檢測技術(shù)也得到很大更新發(fā)展，目前診斷早期HIV感染的主要方法還是血清HIV抗體檢測。（1）初篩試驗：臨床檢測HIV抗體的主要方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。第一代HIV抗體檢測試劑是于1985年誕生，目前已發(fā)展到第四代。第一代ELISA檢測試劑存在很多不足，比如：病毒抗原或病毒裂解物作為抗原包裹反應板，樣品被不同程度的感染雜蛋白與宿主細胞，有著較高的假陽性率，如此以來，對評估HIV感染情況造成一定影響[2-3]?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展推動診斷HIV技術(shù)更新，采用基因工程重組或人工合成肽為包被抗原，能同時檢測HIV-1和HIV-2，特異性較第1代有了很大提高。早在上個世紀末， 第二代試劑就包括了gp36、gp42等抗原，基因有助于混合多種抗原，特性單一，對比第一代試劑，有著較高的特異性，并提高檢出時間。第三代檢測方法主要是雙抗原夾心法，可以同時檢測出IgM抗體，對比第二代試劑可以提前4-5 d檢測出HIV抗體，目前已普遍應用于初篩HIV。第四代試劑可以同時檢測出p24抗原與HIV抗體，更加提升檢測特異度與敏感度，并提升明確窗口期比率[4]。盡管ELISA法檢測效果取得顯著上升，然而因為技術(shù)原因，難以排除相互干擾的可能性，對比分析單獨抗原抗體，有著不高的靈敏性。伴隨其他檢測技術(shù)的出現(xiàn)與日臻完善，此方法可以大為提高綜合檢測HIV患者效率，這些新技術(shù)包括：時間分辨熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析技術(shù)。（2）確認試驗：HIV初篩試驗會存在一些假陽性，樣本經(jīng)初篩試驗結(jié)果呈陽性，還應當實施確認試驗，對受檢者的感染情況進行復查，排除誤診。①免疫印跡試驗（WB）：此方法是確認HIV的唯一手段，并被認可為檢驗HIV病毒的金標準，與ELISA法相比，WB檢測HIV不同的抗原組分，有著較高的特異度及靈敏度，然而此方法有著比較復雜的檢測流程，且檢測成本高，很多時候會因為誤判與不按規(guī)程檢測，會導致假陽性[5-6]。應用WB復檢HIV初篩結(jié)果，有4%-20%陽性樣本可能存在無法確定的情況，這主要與p24結(jié)合非特異性抗體存在關(guān)聯(lián)，所以通常需要經(jīng)驗豐富的醫(yī)師來確定檢驗結(jié)果[7]。②細胞免疫熒光檢測（IFA）：此方法就是在特異性一抗與HIV感染細胞相結(jié)合的前提下，把用熒光標記的二抗與一抗相結(jié)合，染色呈陽性，就可確定為真陽性[8]。此方法操作流程便捷，對比ELISA法，有著更佳的特異性與靈敏度。但此法需要昂貴的熒光顯微鏡，需要接受良好訓練的技術(shù)人員，觀察和解釋結(jié)果易受主觀因素的影響，實驗結(jié)果不宜長期保存，在判定檢測結(jié)果時，有一些患者樣本，因為存在非特異性熒光，從而對結(jié)果評估產(chǎn)生影響。故IFA不宜在一般的實驗室開展和應用。③放射免疫沉淀試驗（RIPA）：此方法的檢測原理是當受檢者血清中的HIV抗體結(jié)合同位素標記的HIV蛋白，與葡萄球菌蛋白A產(chǎn)生反應后，出現(xiàn)免疫沉淀物，利用放射自顯影技術(shù)，觀察有無同位素標記蛋白條帶，最終確定感染切口[9-10]。此方法的特異度與靈敏度都較高，然而使用試劑流程復雜，再加上同位素放射性，對環(huán)境有污染風險，同時需要嚴格保護操作者，故阻礙了此方法的普遍推行。④化學發(fā)光免疫分析法。此檢測方法是遵循發(fā)光強度與標準曲線，對待測物的含量進行檢測，從而檢測血液中HIV，可以于抗原上標記酶，或者于抗體上標記發(fā)光物質(zhì)，進行免疫反應后，添加酶底物或氧化劑，從而對機體含量進行檢測。此檢測方法有著較長有效期限，不會造成污染，有著寬泛的線性領(lǐng)域與較高的靈敏度。⑤電化學發(fā)光免疫分析法（ECLIA）。此檢測方法是綜合各種技術(shù)而成的檢測方法，包括磁性微珠包被技術(shù)、生物素-親和素技術(shù)、電化學發(fā)光技術(shù)等，有著較高靈敏性，可以大幅度降低批內(nèi)、批間的誤差，以提供更為精準的檢測結(jié)果。此方法于封閉且流動系統(tǒng)內(nèi)進行檢測，可以較好防止發(fā)生交叉污染，試劑的穩(wěn)定性高，結(jié)果更具可靠性。此方法最大特點為可以有效壓縮分析時間，只要20 min，比酶聯(lián)免疫吸附法檢測速度更快。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ECLIA還有一個特點是對比酶聯(lián)免疫吸附法，ECLIA檢測線性領(lǐng)域超出4個數(shù)量級，從而更好防止出現(xiàn)因前帶倒鉤所致的假陰性現(xiàn)象，此方法有著較好的穩(wěn)定性與重復性，能夠進行批量化分析，大大壓縮診斷窗口期。然而此法有著較高成本，目前還無法推廣至基層醫(yī)院。

2 病原學檢驗

臨床常用的HIV病原學檢驗方法主要有以下：p24抗原檢驗、病毒分離培養(yǎng)、核酸檢驗。（1）病毒分離培養(yǎng)：此種檢驗手段主要用于篩選抗病毒藥物、取得原始臨床毒種，同時可以對半數(shù)抑制藥物濃度與細胞半數(shù)感染單位進行確定[11]。評估是否感染HIV最精準的手段就是病毒分離培養(yǎng)，然而此方法因為影響因素較多，故不宜運用于常規(guī)診斷。病毒分離培養(yǎng)最普遍使用的方法就是共同培養(yǎng)HIV-1感染者的靶細胞與PBMCS[12]。然而，目前在我國HIV-1分離成功率較低。HIV-1分離會受到以下因素的影響：病程發(fā)展、靶細胞種類、靶細胞活化狀況、病毒載量、CD4 T淋巴細胞、輔助受體表達水平等，選擇共同培養(yǎng)多人的PBMCS，采用不同方法提高病毒分離成功比率，比如：剔除PBMCS中CD8。在分離當中，病毒自身因素會起到極大作用，比如：細胞嗜性、感染力度。 研究艾滋病當中，核心基礎技術(shù)就是HIV分離培養(yǎng)[13-14]。研究HIV生物學表型、篩選藥物、表型抗藥性、中和抗體親合特性等發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)有助于確診HIV感染。對影響分離培養(yǎng)的因素進行研究發(fā)現(xiàn)，決定能否成功分離核心就是靶細胞狀況，靶細胞的活化狀況、靈敏度都會影響病毒分離的效率[15]。挑選完全活化、新鮮的正常人PBMC，有助于提高病毒分離比率。感染者機體包含的病毒載量大小，很大程度上會對能否順利分離病毒有很大影響。此外，病毒分離還會受到共培養(yǎng)中細胞體積和濃度的影響。（2）HIV p24抗原檢測：人體感染HIV后，最先被檢測出的是HIV病毒RNA，接著才是p24抗原，最后檢測出的是HIV抗體。一般處在窗口期與HIV-1抗體不確定階段應用p24抗原檢測，此檢測可以評估病情變化與治療效果，還可以判定嬰兒有無早期母嬰傳播的情況[16]。HIV處在急性感染階段，p24抗原就會最早出現(xiàn)，可以間接體現(xiàn)病毒復制狀況。HIV感染被確診后，需要對每位感染者的臨床與實驗室指標進行評定，從而明確HIV感染時期。臨床采用ELISA雙抗體夾心法檢驗，此方法的靈敏度不高，只能作為診斷的備選輔助手段，需要對感染者進行隨訪，并且再次檢驗確定RNA[17]。目前臨床運用以下檢驗手段大大提升檢測出p24蛋白的機率：超敏感酶免疫測定法（UEI）、免疫復合物裂解檢測法（ICD）、線性免疫酶測定（LIA）等[18]。（3）核酸檢驗（NAT）：目前HIV最敏感檢驗方法就是核酸檢驗，其是依托聚合酶鏈反應（PCR），對RNA拷貝數(shù)進行檢測，評定HIV病情進展與變化?？截悢?shù)越高說明病情進展速度更快。但病毒載量檢測不用作診斷工具，因為存在假陽性或假陰性。病毒基因組的定性檢測可作為感染的標志。但它可以在特殊情況下補充或替代抗體檢測來診斷HIV感染，比如：HIV感染母親產(chǎn)下的新生兒，由于來自母體的抗體，在18個月齡前都有可能HIV抗體陽性。對于暴露的嬰兒，至少2次核酸檢測結(jié)果陰性，才能排除HIV感染。

3 無創(chuàng)性抗體檢驗

傳統(tǒng)檢驗方法主要是檢驗機體的血液或血清，而這些檢驗方式有著復雜的檢驗流程，給受檢人員帶去很大痛苦。近些年來，醫(yī)療科技的快速發(fā)展，檢驗HIV抗體的內(nèi)容得到擴大，由過去僅檢查血液或血清，發(fā)展到提取受檢人員的尿液或唾液，以診斷疾病。此種檢驗方法不會給受檢人員帶去創(chuàng)傷，極大壓縮受檢時間，盡管此方法的檢驗效果與傳統(tǒng)檢驗方法沒有多大區(qū)別，然而很大程度上，緩解患者痛苦，此方法成為檢驗艾滋病技術(shù)的創(chuàng)新。

4 抗體親和力檢驗

抗體親和力檢驗可以有效區(qū)分新近感染與過往感染，有利于流行病學調(diào)查。其工作原理就是與過往感染患者相比，新近感染者HIV抗體滴度、親和力都偏低，在適當處理樣本后，檢驗抗體親和力、滴度，最終鑒別為新近感染或是過往感染[19-20]。此項技術(shù)是借助HIV抗原抗體復合物抵抗分離試劑的強度鑒別新近感染與過往感染，一般選擇ELISA試劑進行檢驗。

5 小結(jié)

對于HIV病毒，需要給予有效檢測，并及時采取干預和治療措施，從而減緩其進展為艾滋病的進程，降低其危害程度。篩查艾滋病主要手段為HIV抗體檢查，而實施篩查的實驗室質(zhì)量會直接影響到篩查結(jié)果。在實際檢測過程中，應當不斷完善有關(guān)制度，同時努力提升操作人員的檢測專業(yè)技能，盡量防止有假陽性或假陰性檢測結(jié)果出現(xiàn)。所以，臨床需要充分掌握檢驗技術(shù)，從根本上預防與控制艾滋病。在提高有關(guān)操作人員的專業(yè)技能的前提下，人民群眾還需要有主動測意識，二者有機結(jié)合，方可盡早確定HIV感染，并及時進行有效干預，延緩進展為艾滋病的進程，提高HIV感染者的生活質(zhì)量。