劉學(xué)停，蔡 軍，孫艷軍，孫登群

膽管癌是惡性程度極高的一類消化系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床上所指的膽管癌是肝外膽管癌，包括肝門部膽管癌和遠(yuǎn)端膽管癌。因?yàn)榧膊〉脑缙谠\斷難度大、腫瘤的惡性程度高、局部解剖特點(diǎn)復(fù)雜，膽管癌的根治性切除率較低、預(yù)后較差，術(shù)后5年總體生存率不足5%[1,2]。目前關(guān)于膽管癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知不足，已有研究證實(shí)多種原癌基因、抑癌基因在膽管癌中異常表達(dá)[3-6]，但調(diào)控原癌基因、抑癌基因表達(dá)的機(jī)制仍有待探究。微小RNA(microRNA，miR)是具有廣泛生物學(xué)功能的非編碼小分子RNA，對(duì)多種原癌基因、抑癌基因的表達(dá)具有調(diào)控作用并在多種消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。膽管癌相關(guān)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，miR-155b能夠靶向原癌基因細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)并抑制膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示miR-155b可能參與膽管癌的發(fā)生發(fā)展[7]。為了明確miR-155b在膽管癌發(fā)生及病情轉(zhuǎn)歸中的作用，本研究探究了膽管癌中miR-551b表達(dá)變化的臨床意義并采用生物信息學(xué)的方法分析了miR-551b的靶基因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014-10至2018-10在我院行膽管癌根治術(shù)的78例患者作為膽管癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理診斷為膽管癌；(2)臨床和病理資料完整；(3)隨訪資料完整；(4)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過(guò)放化療；(2)既往有其他惡性腫瘤病史。另取同期因膽管結(jié)石行Roux-en-Y膽腸吻合術(shù)的40例患者作為對(duì)照組，術(shù)中留取正常膽管組織。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。膽囊癌組中男42例，女36例，年齡39～72歲，平均(51.49±12.92)歲；對(duì)照組中男23例，女17例，年齡32～71歲，平均(48.95±13.12)歲。兩組間一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 miR-551b表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè) 取膽管癌組織和正常膽管組織，采用天根公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照miRNA提取分離試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作、分離組織中的miRNA，按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作、將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系，按照95 ℃預(yù)變性3 min后95℃ 5 s、60 ℃ 15 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，軟件生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)，根據(jù)Ct值計(jì)算miR-551b的表達(dá)量。

1.2.2 臨床病理特征的收集 回顧膽囊癌患者的病史資料，收集以下臨床病理特征的信息：性別、年齡、術(shù)前CEA含量、術(shù)前CA19-9含量、TNM分期、腫瘤分化程度、微血管侵犯情況。術(shù)前CEA≥5 ng/ml為含量升高、CA19-9≥37 U/ml為含量升高，TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，腫瘤分化、微血管侵犯參照術(shù)中所見及術(shù)后病理結(jié)果判斷。

1.2.3 生存期的隨訪 采用回顧門診復(fù)診資料以及電話回訪的方式進(jìn)行生存期的隨訪，隨訪截止日期為2019-10，根據(jù)死亡時(shí)間計(jì)算患者的總生存期(overall survival，OS)。

1.2.4 miR-551b靶基因的生物信息學(xué)分析 在Targetscan網(wǎng)站中進(jìn)行miR-551b靶基因的生物信息學(xué)分析，錄入miR-551b后分析miR-551b靶向的基因及位點(diǎn)。

1.2.5 miR-551b靶基因的western blot檢測(cè) 取膽管癌組織和正常膽管組織，加入RIPA裂解液后研磨組織，研磨液在4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min,離心20 min，收集上清液并測(cè)定蛋白含量，取30 μg蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)。將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，電泳、電轉(zhuǎn)NC膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉NC膜1 h，4 ℃孵育cyclinD1及β-actin的抗體過(guò)夜；次日，洗膜后室溫孵育二抗1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 膽管癌組織和正常膽管組織中miR-551b表達(dá)量的比較 正常膽管組織和膽管癌組織中miR-551b的表達(dá)量分別為(0.78±0.22)和(0.48±0.15)，后者表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.115，P<0.05)。

2.2 不同臨床病理特征膽管癌組織中miR-551b表達(dá)量的比較 不同性別、年齡患者膽囊癌組織中miR-551b表達(dá)量的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)前血清CA19-9升高、CEA升高、TNM Ⅲ期、低未分化、微血管侵犯患者膽囊癌組織中miR-551b的表達(dá)量明顯低于術(shù)前血清CA19-9正常、CEA正常，TNM Ⅰ-Ⅱ期、中高分化、無(wú)微血管侵犯的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 不同miR-551b表達(dá)患者總生存期的比較 與miR-551b高表達(dá)的膽管癌患者比較，miR-551b低表達(dá)的膽管癌患者的總生存期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

表1 膽管癌患者臨床、病理特征與癌組織中miR-551b的表達(dá)量分析

圖1 膽管癌患者miR-551b表達(dá)狀況總生存期比較

2.4 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學(xué)分析及臨床樣本驗(yàn)證 在Target scan網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析，miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462堿基、1479-1486堿基，見圖2。進(jìn)一步采用western blot檢測(cè)cyclinD1的表達(dá)量，蛋白條帶見圖3，正常膽管組織和膽管癌組織中cyclinD1的表達(dá)量分別為(0.55±0.21)和(0.87±0.28),膽管癌組織中cyclinD1的表達(dá)水平明顯高于正常膽管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.184、P<0.05)；膽管癌組織中cyclinD1的表達(dá)水平明顯高于正常膽管組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)且cyclinD1的表達(dá)與miR-551b 的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05，圖4)。

圖2 miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學(xué)分析

圖3 膽管癌患者正常膽管組織和膽管癌組織中cyclinD1表達(dá)的western blot檢測(cè)

圖4 膽管癌患者癌組織中miR-551b與cyclinD1的相關(guān)性

2.5 膽管癌患者生存影響因素的Cox回歸模型分析 以膽管癌患者的預(yù)后作為應(yīng)變量，以性別、年齡、術(shù)前血清CA19-9及CEA、TNM分期、分化程度、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達(dá)作為自變量，經(jīng)Cox回歸模型分析，術(shù)前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達(dá)是預(yù)后的影響因素(P<0.05，表2)。

表2 膽管癌78例生存影響因素的Cox回歸模型分析

3 討 論

膽管癌的惡性程度高、早期診斷難度大，臨床上尚缺乏十分有效的治療手段，手術(shù)切除輔助以放化療的治療方式預(yù)后差、5年生存率低。膽管癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，直接制約了靶向治療藥物的研發(fā)，因此，研究膽管癌的發(fā)病機(jī)制、尋找膽管癌發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控基因是近些年相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-10]，探明促進(jìn)膽管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因不僅能夠?yàn)榘l(fā)病機(jī)制的研究提供理論支持，還有利于臨床工作中早期篩查疾病、準(zhǔn)確判斷病情及預(yù)后。

miRs參與多種基因表達(dá)的調(diào)控，靶向抑癌基因的miR能夠起到促癌作用，靶向原癌基因的miR能夠起到抑癌作用。MiR-551b是具有抑癌作用的miR，在胃癌、結(jié)腸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變中均呈低表達(dá)趨勢(shì)[11-13]。Wang等[4]關(guān)于miR-551b與膽管癌關(guān)系的研究證實(shí)，膽管癌組織及膽管癌細(xì)胞中miR-551b的表達(dá)減少，過(guò)表達(dá)miR-551b能夠抑制膽管癌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期，同時(shí)也能抑制膽管癌移植瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)膽管癌組織中miR-551b表達(dá)的分析結(jié)果與Wang等[4]研究結(jié)果一致。

癌細(xì)胞過(guò)度增殖是膽管癌重要的病理特征，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了miR-551b低表達(dá)與膽管癌臨床病理特征的關(guān)系，術(shù)前血清CA19-9及CEA升高、TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯與膽管癌中miR-551b表達(dá)減少有關(guān)。CA19-9及CEA是消化道惡性腫瘤常用的標(biāo)志物，雖然特異性較弱，但術(shù)前血清CA19-9及CEA的升高能夠在一定程度上反映腫瘤負(fù)荷的增加及病灶內(nèi)癌細(xì)胞活躍的增殖；TNM分期增加、分化程度降低、微血管侵犯直接反映腫瘤病理特征惡化，提示癌細(xì)胞較強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為。結(jié)合本研究的分析結(jié)果，膽管癌miR-551b的低表達(dá)與病理特征的惡化有關(guān)。

miR本身不直接參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為的調(diào)控，其生物學(xué)作用的實(shí)現(xiàn)依賴于靶基因表達(dá)的調(diào)控，與靶基因mRNA 3’UTR結(jié)合后能夠使mRNA降解或阻礙mRNA反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。Chang等[7]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-551b能夠在膽管癌細(xì)胞中靶向抑制cyclinD1。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析驗(yàn)證了這一靶向調(diào)控作用并發(fā)現(xiàn)：miR-551b靶向cyclinD1基因mRNA 3’UTR的第1456-1462堿基、1479-1486堿基。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，能夠加速細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。國(guó)外Sittithumcharee等[14]及國(guó)內(nèi)田立斌等[15]的研究均表明，cyclinD1的高表達(dá)參與膽管癌的發(fā)生發(fā)展。本研究的分析與前人的研究一致，即膽管癌中cyclinD1的表達(dá)量高于正常膽管組織。此外，本研究還證實(shí)了膽管癌中miR-551b與cyclinD1具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，結(jié)合miR-551b靶向cyclinD1的生物信息學(xué)分析及他人的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，靶向抑制cyclinD1是miR-551b參與膽管癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)膽管癌患者術(shù)后的生存情況進(jìn)行了隨訪，經(jīng)生存曲線分析可知：膽管癌中miR-551b低表達(dá)患者的總生存期較短，與miR-551b低表達(dá)和膽管癌病理特征惡化的分析結(jié)果吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-551b參與膽管癌發(fā)生發(fā)展的結(jié)論。此外，本研究還在COX回歸模型中分析了膽管癌患者總生存期的影響因素，術(shù)前CA19-9、TNM分期、微血管侵犯、miR-551b及cyclinD1表達(dá)被證實(shí)與膽管癌患者的遠(yuǎn)期生存相關(guān)，由此也進(jìn)一步明確miR-551b低表達(dá)在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上所述，膽管癌中miR-551b表達(dá)減少與病理特征惡化、總生存期縮短相關(guān)，靶向cyclinD1是miR-551b參與膽管癌發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，今后miR-551b有望成為闡明膽管癌發(fā)病機(jī)制的候選基因，也可以將miR-551b作為靶點(diǎn)深入研究膽管癌的靶向治療方法。