李景芬 夏正龍 欒 生 蔡繆熒 羅 坤 唐瓊英 高權(quán)新 孔 杰 楊國(guó)梁,

(1. 湖州師范學(xué)院 浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖州 313000; 2. 江蘇數(shù)豐水產(chǎn)種業(yè)有限公司, 高郵 225654; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)又名馬來(lái)西亞大蝦、淡水長(zhǎng)臂大蝦, 是世界上最大的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。原產(chǎn)于東南亞地區(qū)以及大洋洲北部和西太平洋島嶼[1]。我國(guó)于1976年從日本引進(jìn)羅氏沼蝦,此后, 它在中國(guó)沿海各省得到發(fā)展和推廣。20世紀(jì)90年代, 隨著大規(guī)模人工孵化和育苗技術(shù)的進(jìn)步, 我國(guó)羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展, 已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要品種之一[2]。到2009年, 我國(guó)連續(xù)10年成為世界第一的羅氏沼蝦養(yǎng)殖大國(guó)[3]。2010—2018年,我國(guó)羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量除2013年為1.174×108kg, 其余各年產(chǎn)量均在1.2×108kg以上, 2013—2017年產(chǎn)量連年持續(xù)增長(zhǎng), 2017年產(chǎn)量達(dá)1.374×108kg[4]。但是,由于近交和有限的小群體繁殖, 使養(yǎng)殖品種遺傳多樣性減少, 出現(xiàn)種質(zhì)退化, 表現(xiàn)為抗病力下降、生長(zhǎng)緩慢和性成熟提早等現(xiàn)象, 已成為影響羅氏沼蝦產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的嚴(yán)重問(wèn)題[5]。而遺傳多樣性與種群的生存能力、適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力呈正相關(guān), 是物種進(jìn)化的基礎(chǔ)[6]。因此, 研究現(xiàn)有羅氏沼蝦種質(zhì)資源的遺傳多樣性對(duì)羅氏沼蝦種質(zhì)資源的有效利用、改良養(yǎng)殖種群的經(jīng)濟(jì)性狀、選育優(yōu)良的新品種及研究種群的遺傳結(jié)構(gòu)等具有重要意義。

種群遺傳分析已被證明是評(píng)價(jià)物種種群遺傳多樣性和獲取遺傳結(jié)構(gòu)信息的最佳方法[7]。微衛(wèi)星標(biāo)記被認(rèn)為是進(jìn)行種群遺傳分析最為有效的分子標(biāo)記之一, 因其具有共顯性、高突變率、遍布全基因組、易于評(píng)分和能夠提供豐富的遺傳信息等特

點(diǎn)而被廣泛采用。因此, 在研究羅氏沼蝦群體遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)方面, 微衛(wèi)星標(biāo)記也是被廣泛采用的標(biāo)記之一。國(guó)內(nèi)外關(guān)于羅氏沼蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[8—11]及利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究其遺傳變異的[12—17]已有一些報(bào)道。但是同時(shí)對(duì)來(lái)自4個(gè)國(guó)家的羅氏沼蝦群體的研究卻鮮有報(bào)道, 且這4個(gè)國(guó)家均普遍養(yǎng)殖羅氏沼蝦。此外, 研究羅氏沼蝦群體遺傳變異的微衛(wèi)星標(biāo)記量大多在5—12個(gè)[12—17], 而戴習(xí)林等[17]研究顯示: 當(dāng)標(biāo)記量5—25時(shí), 等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)等遺傳參數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢(shì), 當(dāng)標(biāo)記量大于20時(shí),各遺傳多樣性指數(shù)值已無(wú)顯著性差異。鑒于此, 本研究采用16個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記, 對(duì)3個(gè)國(guó)外引進(jìn)群體和2個(gè)本國(guó)養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析, 以期為羅氏沼蝦種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用和優(yōu)良品種的選育提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的羅氏沼蝦分別來(lái)自泰國(guó)(CP)、孟加拉(BD)、緬甸(MN)和江蘇數(shù)豐水產(chǎn)種業(yè)有限公司(MP和DP)。MP是一個(gè)不同家系的混養(yǎng)群, DP是一個(gè)擴(kuò)繁群。CP 13尾, BD 15尾, MN 16尾, MP 74尾和DP 29尾, 每個(gè)個(gè)體剪取蝦背部肌肉組織, 于無(wú)水乙醇中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

取出無(wú)水乙醇固定的蝦肉于1.5 mL離心管中,揮發(fā)干乙醇, 用小剪刀盡量剪碎, 加入裂解液和蛋白酶K混勻, 于55℃搖床中消化至溶液澄清透明。再向裂解液中加入RNase于37℃水浴鍋中保溫1h。然后按傳統(tǒng)的酚、氯仿和異戊醇法提取基因組DNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性, 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量濃度, 并稀釋至50 ng/μL, 存于–20℃冰箱中備用。

引物詳細(xì)信息見(jiàn)表 1, 引物均由武漢天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系總體積25 μL: 10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1 μL, 引物2 μL, 50 ng/μL DNA 2 μL, rTaq0.2 μL,ddH2O 17.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性4min; 94℃變性30s, 54—65℃退火30s, 72℃延伸1min, 30個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min, 4℃終止延伸5min。

STR基因分型委托上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司完成。采用美國(guó)ABI公司的PRISM3730測(cè)序儀進(jìn)行STR序列分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)個(gè)體的基因型通過(guò)STR基因分型確定, 根據(jù)等位基因的大小, 按照從小到大按字母排序。Na、Ne、Ho、He、Shannon指數(shù)(I)、Nei氏遺傳距離和遺傳相似度采用Popgene Version1.32軟件計(jì)算;等位基因豐度(Ar)采用HP-Rare 1.0軟件計(jì)算[18]; 多態(tài)信息含量(PIC)采用Cervus3.0軟件計(jì)算。

表 1 羅氏沼蝦16對(duì)微衛(wèi)星引物信息Tab. 1 16 pairs of microsatellite primers of M. rosenbergii

群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)、群體分子方差分析(AMOVA)采用Arlequin 3.5軟件進(jìn)行[19]。系統(tǒng)樹(shù)根據(jù)Nei氏遺傳距離通過(guò)MEGA 5軟件采用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法(UPGMA)構(gòu)建[20], 群體遺傳結(jié)構(gòu)采用STRUCTURE 2.3.1軟件分析[21]、最佳K值(理論群體數(shù))和群體遺傳結(jié)構(gòu)圖利用在線軟件(http://clumpak.tau.ac.il/)得出。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性及群體遺傳多樣性

如表 2所示, 16個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)出298個(gè)Na, 等位基因數(shù)介于8—26個(gè), 每個(gè)位點(diǎn)平均有17個(gè)等位基因。Ne介于3.3432—10.3126, 平均值為6.3777個(gè)。I介于1.4339—2.5118, 平均值為2.1662。Ho介于0.1168—0.8095, 平均值為0.4664。He介于0.7033—0.9063, 平均值為0.8316。PIC介于0.6364—0.8152,平均值為0.7328。根據(jù)Botstein等[22]的標(biāo)準(zhǔn),PIC≥0.5為高度多態(tài)性, 本研究中的16個(gè)位點(diǎn)均為高度多態(tài)性位點(diǎn), 說(shuō)明這些位點(diǎn)均可提供豐富的遺傳信息,可用于羅氏沼蝦群體遺傳多樣性的評(píng)估。F檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示, 在16個(gè)位點(diǎn)中, 有1個(gè)位點(diǎn)的近交系數(shù)(Fis)值為負(fù)值, 其余15個(gè)位點(diǎn)為正值, 表明近交程度較高。16個(gè)位點(diǎn)遺傳分化指數(shù)(Fst)的平均值為0.0977, 根據(jù)Wright[23]建議, 有1個(gè)位點(diǎn)遺傳分化程度較大(Fst= 0.1503>0.15), 其余15個(gè)位點(diǎn)遺傳分化程度中等(0.05

如表 3所示, DP群的Na(6.4375)、Ne(3.6574)、Ar(5.4524)、He(0.7025)、I(1.4454)和PIC(0.6538)均為最低, 而MP群的Na(13.6875)、Ne(6.2415)和I(2.0680)均為最高。MP群的Ho(0.4505)為最低, CP群的Ho(0.5321)、He(0.8594)、Ar(8.6198)和PIC(0.8048)為最高。所有群體的PIC均大于0.5, 表明群體的遺傳多態(tài)性較高, 具有較大的選擇潛力。5個(gè)群體的PIC從高到低排列依次為CP>MP>BD>MN>DP, 與各群體平均等位基因豐度(Ar)的大小順序相吻合,更加說(shuō)明CP群體具有較高的等位基因豐度, 而DP群體的等位基因豐度相對(duì)較低。

2.2 群體的遺傳分化及遺傳距離

如表 4所示, 根據(jù)Wright[23]的建議, MP群體與MN群體之間的遺傳分化水平最低(Fst=0.03430),MP群體與MN群體、與BD群體(Fst=0.03876)均屬于低程度的遺傳分化(Fst<0.05)。CP群體與DP群體之間的遺傳分化水平最高(Fst=0.17333), CP群體與DP群體、與MN群體(Fst=0.15495)均屬于較大程度的遺傳分化(0.15

表 2 羅氏沼蝦微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)和基因流的估計(jì)Tab. 2 Genetic diversity parameters and the estimates of gene flow among 16 loci of M. rosenbergii

表 3 五個(gè)羅氏沼蝦群體的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity of five populations of M. rosenbergii

表 4 五個(gè)羅氏沼蝦群體間的遺傳分化指數(shù)Tab. 4 Matrix of pair-wise Fst values between five populations of M. rosenbergii

如表 5所示, 群體間變異占總變異的6.22%, 且達(dá)到顯著水平(P<0.05), 群體內(nèi)個(gè)體間的變異占總變異的40.72%(P<0.05), 個(gè)體內(nèi)部的遺傳變異占總變異的53.07%(P<0.05)。這表明個(gè)體間的遺傳變異遠(yuǎn)大于群體間的遺傳變異, 遺傳變異主要存在于個(gè)體間。Fst值為0.06215, 群體間有中等程度的遺傳分化。

如表 6所示, 5個(gè)群體間的Nei氏遺傳距離介于0.1823—1.4184。MN群體與CP群體間的Nei氏遺傳距離最遠(yuǎn)(1.4184), 遺傳相似度最低(0.2421)。MN群體與MP群體Nei氏遺傳距離最近(0.1823), 遺傳相似度最高(0.8334)。根據(jù)Nei氏遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)(圖 1), MN群體首先與MP群體聚為一類(lèi), 再與DP群體聚為一類(lèi), 之后再與BD群體聚為一類(lèi), 最后與CP群體聚為一類(lèi)。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究Length of Burn-in Period設(shè)置為100000,預(yù)設(shè)K值(理論群體數(shù))為1—9, 每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)算10次。采用Evanno等[21]的方法進(jìn)行分析計(jì)算, 得到最佳K值為5, 此時(shí)的DeltaK最大, 表明本研究中所有參試個(gè)體最佳可劃分為5個(gè)理論群(圖 2)。由圖 2可知, DP、MN、BD、CP群體的個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)相對(duì)獨(dú)立, 尤其是CP群體的個(gè)體, 而MP群體的個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)有一定程度的混雜, 且該群體的遺傳組成多樣化。

表 5 五個(gè)羅氏沼蝦群體的分子方差分析Tab. 5 AMOVA analysis among five populations of M. rosenbergii

圖 1 基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的5個(gè)羅氏沼蝦群體的 UPGMA聚類(lèi)樹(shù)Fig. 1 UPGMA clustering tree of five populations of M. rosenbergii based on Nei’s genetic distance

圖 2 羅氏沼蝦群體在K=5下的遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 STRUCTURE genetic cluster analysis for the five populations of M. rosenbergii (K=5)

3 討論

3.1 群體遺傳多樣性

遺傳多樣性與物種的生存力、適應(yīng)力和進(jìn)化潛力密切相關(guān), 是評(píng)估種群資源狀況的重要依據(jù)[24]。等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)是反應(yīng)群體遺傳多樣性的主要參數(shù), 且與遺傳多樣性和基因豐度呈正相關(guān)[25,26]。但是, 在樣本量差異較大時(shí)利用等位基因數(shù)來(lái)衡量遺傳多樣性是不準(zhǔn)確的, 原因在于等位基因數(shù)量(等位基因豐度)高度依賴(lài)于樣本的大小: 大樣本比小樣本包含更多的等位基因[27]。本研究中國(guó)外群體引種而來(lái), 樣本量較少, 為排除不同群體間較大樣本量差異的影響, 采用HP-Rare軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)等位基因豐度的無(wú)偏估計(jì),5個(gè)群體的Ar介于5.4524—8.6198。由于等位基因數(shù)(Na)依賴(lài)于樣本大小的缺陷, 致使期望雜合度(He)更常用于衡量群體的遺傳多樣性[18]。本研究群體的He介于0.7025—0.8594, CP群體的He最高, 為0.8594, 與孫成飛等[16]的報(bào)道相比, 介于其泰國(guó)1(He=0.881)和泰國(guó)2(He=0.848)之間, 其他群體的He都低于孫成飛所報(bào)道群體的He(介于0.848—0.896); 與鐘丹丹等[15]的報(bào)道相比, 其所研究的兩個(gè)群體的He(0.7376和0.7609)處于本研究He的范圍內(nèi); 與朱其建等[17]的報(bào)道(He介于0.5519—0.7332)相比, 本研究結(jié)果偏高; 與Schneider等[12]的報(bào)道(He介于0.5794—0.9356)相比, 本研究群體的He處于中等水平; 與Nguyen Thanh等[14]的報(bào)道(He介于0.785—0.835)相比, 本研究中的DP群和MN群的He略偏低, 其余群體的He與之基本一致。通過(guò)與他人研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn), 本研究中群體的He處于中等水平。戴習(xí)林等[17]的研究也表明樣本量與平均等位基因數(shù)和平均有效等位基因數(shù)呈高度正相關(guān), 與雜合度呈中度相關(guān)?？梢酝浦跇颖竞孔銐虻那闆r下, MN、BD和CP群體的等位基因數(shù)和雜合度會(huì)更高。Qin等[28]研究表明雜合度越高物種遺傳多樣性越豐富, 對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力則越強(qiáng)。當(dāng)群體雜合度在0.5—0.8即可認(rèn)為具有較高的多樣性[29], 當(dāng)PIC>0.5即認(rèn)為有高度多態(tài)性[22], 5個(gè)群體的平均PIC(0.7328)和平均期望雜合度(0.7829)均在0.7以上, 表明各研究群體的遺傳多樣性均處于較高水平, 說(shuō)明這些群體種質(zhì)資源良好、有一定的種群穩(wěn)定性, 具有很大的選擇潛力。

本研究中每個(gè)群體的Ne均小于Na, 王豐等[30]認(rèn)為主要是等位基因在群體中分布不均, 導(dǎo)致某些等位基因的頻率不夠均勻。這說(shuō)明本研究中各群體均存在等位基因分布不均勻的情況, 這種不均勻程度依次為MP>BD>MN>DP>CP。

3.2 群體遺傳分化

遺傳分化指數(shù)(Fst)是用來(lái)衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)。5個(gè)羅氏沼蝦群體間的Fst值介于0.03430—0.17333, 表明群體間均有不同程度的遺傳分化。MP群與MN群(Fst=0.03430)、與BD群(Fst=0.03876)間遺傳分化較小, 此結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)際相符, MP群為家系的混養(yǎng)群, 緬甸家系的親本就來(lái)源于MN群, 孟加拉家系親本來(lái)源于BD群。除去MP群, 其余所有群體間均為中等和較大程度的遺傳分化(0.07515≤Fst≤0.17333), 可能因?yàn)檫@些群體分屬不同國(guó)家, 由于地域的限制, 基因交流較少, 而呈現(xiàn)出中等和較大程度的遺傳分化。CP群與DP群和MP群間的Fst值分別為0.17333和0.09502, 分屬較大和中等程度的遺傳分化。系統(tǒng)樹(shù)顯示DP群和MP群最后與CP群聚為一支。這與孫成飛等[16]的研究結(jié)果基本一致, 中國(guó)和泰國(guó)羅氏沼蝦群體間存在中等程度的遺傳分化, 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；蛄?Nm)就是基因在群體間的運(yùn)動(dòng)[31], 是引發(fā)群體內(nèi)和群體間遺傳變異的一個(gè)非常重要的來(lái)源[32]。Wright[33]認(rèn)為當(dāng)Nm大于1時(shí)可以抵制因遺傳漂變?cè)斐傻娜后w間遺傳分化, 使群體間遺傳分化程度降低。本研究中所有位點(diǎn)Nm均大于1, 其平均值為2.3089, 說(shuō)明本研究中的5個(gè)群體不容易因遺傳漂變而引起種群間的分化。

3.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

STRUCTURE軟件是分析群體遺傳結(jié)構(gòu)的理想工具, 因該軟件不受各群體樣本量的影響, 是基于個(gè)體的遺傳組成進(jìn)行群體模擬分析的[21]。本研究所有個(gè)體被劃分為5個(gè)理論群體, 圖 2顯示5個(gè)樣本群基本獨(dú)立成群, 該遺傳結(jié)構(gòu)圖支持聚類(lèi)結(jié)果。MP群是一個(gè)不同家系混養(yǎng)群, 故遺傳結(jié)構(gòu)圖顯示該群由多種遺傳背景的個(gè)體構(gòu)成, 有些個(gè)體的遺傳成分混雜。該群中緬甸家系個(gè)體較多, 所以首先與MN群體聚為一類(lèi)。DP群是親蝦擴(kuò)繁群, 包含MP群的親蝦, 即MP群某些個(gè)體含DP群的血統(tǒng), 且這些個(gè)體數(shù)量?jī)H次于緬甸家系個(gè)體, 所以MP群與MN群聚為一支后再與DP群聚在一起。MP群中也包含孟加拉家系, 只是孟加拉家系個(gè)體稍少, 所以與DP群聚在一起后再與BD群聚在一起。因MP群中無(wú)泰國(guó)家系, 所以最后與CP群聚在一起。

綜上所述, 本研究結(jié)果表明5個(gè)羅氏沼蝦群體存在高度的遺傳多樣性, 說(shuō)明這些群體種質(zhì)資源狀況良好、有一定的種群穩(wěn)定性, 具有較大的選擇潛力。中國(guó)群體與泰國(guó)群體親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。所獲得的基于微衛(wèi)星標(biāo)記的羅氏沼蝦的遺傳數(shù)據(jù)豐富了羅氏沼蝦的遺傳信息, 對(duì)于制定行之有效的選育和保護(hù)策略有一定的參考價(jià)值。