周小芳 張鵬飛 曾會玲 葉恒振 馮 浩 李慧瑩 靳方方 梁智策 郭志強

(1. 海南大學海洋學院, 南海海洋資源利用國家重點實驗室, ?？?570228; 2. 海南大學生命科學與藥學院,熱帶生物資源教育部重點實驗室, ?？?570228)

斜帶石斑魚(Epinephelus coioides), 俗稱青斑,是石斑魚屬極具代表性的養(yǎng)殖品種[1], 我國野生斜帶石斑魚種群主要分布于南海海域和臺灣海峽[2]。海南島東部島嶼是南海斜帶石斑魚最主要的棲息地之一[1,3]。近十幾年來, 我國野生斜帶石斑魚資源日益衰退[3]。因此, 對該魚野生資源的保護已是迫在眉捷。在前期研究過程中, 有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染是斜帶石斑魚資源退化的重要原因之一[1], 但是相關的研究極其缺乏。

重金屬是近海環(huán)境中主要的環(huán)境污染物之一,主要通過水體和食物途徑累積到水生生物體內(nèi)[4,6],對機體產(chǎn)生氧化脅迫、組織損傷和基因突變等毒害作用[7,9]。鉻(Cr)是環(huán)境中常見的重金屬污染物,Cr在環(huán)境中主要以Cr6+和Cr3+兩種價態(tài)存在。即使在較低的濃度下, Cr6+也可能是劇毒的[10]。水體中Cr6+的污染對水生生物及魚類具有生物毒性, 主要包括對細胞水平、免疫水平和抗氧化應激酶等方面具有毒性效應[11,14]。

魚類早期生活階段對外界環(huán)境極為敏感, 即使低濃度的重金屬暴露也可能對其胚胎發(fā)育和仔魚生長存活造成損害, 導致種群數(shù)量和質(zhì)量的降低[15]。因此, 利用魚類胚胎和仔魚對重金屬的毒理學反應進行生物監(jiān)測已成為評價水體污染效應的重要手段[15]。目前重金屬對魚類早期發(fā)育階段研究已取得初步進展, 主要采用孵化率、孵化時間和畸形率等發(fā)育指標展開研究, 常忽略了胚胎發(fā)育階段對污染物的生物累積和分子監(jiān)測指標方面的研究。石斑魚胚胎發(fā)育屬于內(nèi)源性營養(yǎng), 而胰島素樣生長因子2(Insulin like growth factor 2, IGF2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glucose transporter 2, GLUT2)和過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG)這3種基因在生長和營養(yǎng)功能方面起著重要作用, 可用作胚胎發(fā)育的分子指標。igf2具有刺激DNA和蛋白質(zhì)合成, 促進細胞有絲分裂, 調(diào)節(jié)糖原代謝的作用, 是最早發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性印記基因之一, 也是胚胎發(fā)育的主要促進因子[16]。glut2基因和pparg基因分別為糖代謝水平和脂質(zhì)代謝水平的重要基因, 其中g(shù)lut2基因是調(diào)節(jié)胰島素分泌的葡萄糖傳感器[17], 而pparg基因是脂肪組織中調(diào)控脂肪酸代謝的核心轉(zhuǎn)錄因子, 影響脂肪細胞脂肪酸沉積及脂滴形成, 也是脂肪細胞生長、分化的重要指示基因[18]。

為了深入研究重金屬在胚胎發(fā)育過程中的吸收和生物累積規(guī)律及其對胚胎發(fā)育過程中關鍵基因表達的影響, 本實驗研究了水體中Cr6+在斜帶石斑魚胚胎中的生物累積量和吸收率及其對glut2、igf2和pparg基因mRNA表達的影響, 評價Cr6+暴露對石斑魚胚胎細胞發(fā)育和營養(yǎng)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斜帶石斑魚受精卵于2018年4月1日購自海南晨海水產(chǎn)有限公司(陵水基地)。受精卵收集后, 洗凈, 除去未受精的卵, 取上浮受精卵置于孵化桶中用于Cr6+暴露實驗。斜帶石斑魚的受精卵呈圓球形, 為浮性卵, 卵徑為(0.85±0.01) mm, 油球直徑為(0.27±0.01) mm。

實驗所用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)試劑為分析純(CAS No: 7646-85-7, 純度>99.9%, 購自國藥化學試劑公司), 先用去離子水配制成濃度3000 mg/L Cr6+母液備用, 實驗前用膜過濾(0.22 μm濾膜)海水, 并稀釋Cr6+溶液成所需濃度。據(jù)預實驗及相關研究[19,20],確定0.20、0.60、1、5、10、20、40、60、80 mg/L9個Cr6+質(zhì)量濃度梯度進行暴露實驗, 每個濃度設3個平行, 實驗使用500 mL的燒杯, 共20個燒杯, 用10 mL移液槍吸約受精卵(顯微鏡下均為剛受完精魚卵)1萬粒加入各個燒杯中, 實驗期間用氣石曝氣保持水體正常溶氧, 光周期14L﹕10D, 實驗海水鹽度(32±1)‰, 溫度(25±1)℃, pH為7.5±0.30, 溶解氧(6.3±0.80) mg/L(平均值±SD,n=3)。實驗周期為30h, 分別在3h11min (桑葚胚期)、5h42min(囊胚期)、10h45min(原腸末期)、17h30min(腦泡形成期)、24h25min(心臟跳動期)取樣, 用于測定其累積量樣品放置?20℃冰箱, 用于測定分子樣品放置?80℃冰箱, 每個濃度一式5份樣品進行分析。

Cr6+暴露實驗期間, 各處理組中Cr6+的實測濃度誤差均<10%, 符合OECD關于此類實驗誤差在±20%范圍內(nèi)的要求[21]。

1.2 樣品測定

樣品Cr6+含量測定樣品解凍后用蒸餾水清洗兩遍除去表面的Cr6+, 然后置于烘箱65℃下48h烘干至恒重, 稱重后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管, 加入1 mL HNO3(69%, ultrapure, Fisher Scientific, Geel,Belgium), 80℃下消化48h。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS; iCAP RQ Thermo Fisher, USA)測定樣品中的Cr6+含量。

總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司?？偟腞NA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(公司)反轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaq購自TaKaRa公司, 反應在實時定量PCR儀(ABI7500 Real-Time PCR System, 美國)上進行。測出的數(shù)據(jù)用內(nèi)參β-actin進行歸一化處理。

引物設計熒光定量PCR引物采用Primer 5.0軟件設計, 由廣州天一輝遠生物科技有限公司合成, 引物序列及參數(shù)見表 1。

反應體系及條件使用10 μL熒光定量擴增體系, 反應條件為: 95℃ 30s預變性; 95℃ 5s, 58℃30s, 進行40個循環(huán)。每循環(huán)第2步結(jié)束時進行熒光信號收集。每個待測樣品設置3個重復, 對3個閾值循環(huán)(Ct值)取平均值, 以備帶入公式計算。

標準曲線的建立分別將β-actin、igf2、glut2和pparg4個基因的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA-free離子水梯度稀釋成10–9—1, 選擇10–6—1共7個濃度為標準品, 標準品反應條件同上, 設置3個重復?；€由實時定量PCR儀自動設置, 標準曲線由軟件自動分析, 得到斜率和擴增效率。

產(chǎn)物測序PCR產(chǎn)物由廣州天一輝遠生物技術(shù)有限公司測序, 登陸NCBI網(wǎng)站上與所找的魚類的序列同源性比較, 測得同源性均為98%以上。

表 1 為所合成引物序列Tab. 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

吸收率[Jw, μg/(g·h)]通過計算其生物累積量和暴露時長兩個變量的線性回歸方程斜率獲得, 吸收常數(shù)ku按如下公式計算[22]:

式中,ku代表胚胎對水相Cr6+的累積能力, b代表常數(shù),Cw是水相Cr6+濃度(mg/L)。

根據(jù)系統(tǒng)自動分析的igf2、glut2、pparg及βactin標準曲線的斜率可得PCR擴增效率:

式中,E擴增效率, Slope為標準曲線斜率。igf2、glut2、pparg及β-actin的擴增效率都接近100%且相互間效率偏差在5%以內(nèi), 以目的基因mRNA的拷貝數(shù)與對應樣品內(nèi)參基因mRNA的拷貝數(shù)的比值表示基因mRNA的相對表達量。

所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用t檢驗檢查處理組與對照組之間的差異顯著性來判斷其Cr6+暴露對胚胎重金屬吸收、累積及目的基因表達的影響,P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS19.0軟件, 圖表制作采用Sigmaplot和Graphpad prism軟件。

2 結(jié)果

2.1 六價鉻在胚胎發(fā)育過程中的生物累積和吸收率

如圖 1所示, 各發(fā)育時期胚胎的生物累積量隨著濃度的增加而呈線性增加。低濃度Cr6+暴露組(Cr6+≤5 mg/L), 生物累積量在胚胎發(fā)育期間變化不顯著, 而在高濃度Cr6+暴露組(Cr6+為60和80 mg/L),Cr6+在胚胎發(fā)育期間持續(xù)累積。

如圖 2所示, 不同發(fā)育時期的胚胎吸收率不僅隨暴露濃度的增加而增加, 還隨著胚胎的發(fā)育時期而逐漸降低。桑葚胚期、囊胚期、原腸末期、腦泡形成期和心臟跳動期的Cr吸收常數(shù)ku分別是2.79、0.50、0.25、0.18和0.14 L/(g·h)。

2.2 六價鉻暴露對斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期igf2基因的mRNA表達量的影響

圖 1 在不同濃度的Cr6+暴露下的斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期的Cr6+生物累積量Fig. 1 The Cr6+ bioaccumulation (μg/g) in Epinephelus coioides embryos under waterborne Cr6+ treatment

圖 2 在不同濃度的Cr6+暴露下的斜帶石斑魚胚胎不同發(fā)育時期的Cr6+吸收率Fig. 2 The Cr6+ uptake rate [μg/(g·h)]in Epinephelus coioides embryos under waterborne Cr6+ treatment

與對照組相比, 在桑葚期濃度為0.6、1、10和80 mg/L的Cr6+暴露下, 石斑魚胚胎的igf2基因的mRNA的表達量有顯著促進作用(圖 3A,P<0.05);囊胚期時除了在濃度為60 mg/L的Cr6+暴露下, 其他濃度的Cr6+暴露, 對igf2基因mRNA的表達量有顯著促進作用(圖 3B,P<0.05); 在原腸末期時, 僅在濃度為1 mg/L的Cr6+暴露下的表達量有顯著促進作用(圖 3C,P<0.05); 在腦泡形成期時, 在濃度為0.2、0.6、1和5 mg/L的Cr6+暴露下的igf2基因mRNA的表達量有顯著促進作用(圖 3D,P<0.05); 在濃度為10—80 mg/L的Cr6+暴露下的igf2基因mRNA的表達量為顯著抑制作用(圖 3E,P<0.05)。在igf2基因中,在濃度為1 mg/L的Cr6+暴露下的igf2基因mRNA的表達量在整個胚胎發(fā)育時期中為顯著促進作用(圖 3)。

2.3 六價鉻暴露對斜帶石斑魚胚胎發(fā)育過程glut2基因的mRNA表達量影響

與對照組相比, 在桑葚期時, 除了在濃度為20和80 mg/L Cr6+暴露外, 其他濃度的Cr6+暴露對glut2基因的mRNA的表達量有顯著促進作用(圖 4A,P<0.05); 在囊胚期(圖 4B), Cr6+暴露對glut2基因的mRNA的表達量有顯著促進作用(P<0.05); 而在原腸末期(圖 4C)中僅在濃度為0.2—5 mg/L的Cr6+暴露下有顯著促進作用(P<0.05); 在腦泡形成期(圖 4D)時, 僅在濃度為0.6、1和20 mg/L Cr6+暴露下,glut2基因的mRNA的表達量有顯著促進作用(P<0.05);在心臟跳動期(圖 4E)時, 在濃度為0.2、0.6、1、5和20 mg/L的Cr6+暴露下,glut2基因的mRNA的表達量有顯著性作用(P<0.05),glut2基因的mRNA的表達量, 在濃度為80 mg/L的六價鉻暴露下被顯著抑制(P<0.05)。在glut2基因中發(fā)現(xiàn), 濃度為0.2—5 mg/L的Cr6+暴露下, mRNA的表達量在石斑魚胚胎發(fā)育的5個時期中都為顯著促進作用(圖 4)。

2.4 六價鉻暴露對斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期pparg基因的mRNA表達量的影響

與對照組相比, 在桑葚期(圖 5A)和囊胚期(圖 5B)中, Cr6+暴露下的pparg基因的mRNA的表達量被顯著抑制或不表達(P<0.05); 在心臟跳動期(圖 5E)時,僅在濃度為5 mg/L的Cr6+暴露下有顯著促進作用(P<0.05); 在原腸末期(圖 5C)和腦泡形成期(圖 5D)中, Cr6+暴露下的pparg基因的mRNA的表達量有顯著促進作用(P<0.05); 特別是在腦泡形成期(圖 5D)時, 僅在最高濃度80 mg/L暴露下的Cr6+pparg基因的mRNA的表達量無顯著差異。在Cr6+暴露下的石斑魚胚胎在發(fā)育的5個時期中,pparg基因的mRNA的表達水平普遍被抑制或者無明顯差異, 僅在原腸末期(圖 5C)和腦泡形成期(圖 5D)時,pparg基因的mRNA的表達量顯著促進作用(P<0.05)。

圖 3 不同濃度Cr6+暴露下的斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期igf2基因的mRNA的表達水平Fig. 3 The effect of waterborne Cr6+ exposure on insulin like growth factor 2 (igf2) gene expressions in the grouper embryos

圖 4 不同濃度Cr6+暴露下的斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期glut2基因mRNA的表達水平Fig. 4 The effect of waterborne Cr6+ exposure on glucose transporter 2 (glut2) gene expressions in the grouper embryos

圖 5 在不同濃度Cr6+暴露下的斜帶石斑魚胚胎發(fā)育時期的pparg基因的mRNA的表達水平Fig. 5 The effect of waterborne Cr6+ exposure on peroxisome proliferator-activated receptor gamma (pparg) gene expressions in the grouper embryos

3 討論

3.1 斜帶石斑魚胚胎對六價鉻吸收和累積

環(huán)境中Cr6+通過細胞膜離子通道進入細胞并產(chǎn)生危害[23]。本實驗設置更大區(qū)間的Cr6+暴露, 并通過計算動力學參數(shù)首次量化了斜帶石斑魚胚胎對重金屬的吸收和生物累積作用。發(fā)現(xiàn)石斑魚胚胎在Cr6+暴露下的生物累積量隨濃度的增加而增加,暴露濃度越高, 其胚胎的生物累積量越高; 有研究報道, 魚類組織中Cr6+的濃度升高是導致每個營養(yǎng)級水平的生物放大作用產(chǎn)生根本原因, 尤其是底棲肉食性魚類[24]。同時Cr6+及其化合物為劇毒物且容易進入細胞產(chǎn)生毒性[23], 隨著暴露時間的增加, 胚胎的生物累積量逐漸增加并達到飽和狀態(tài), 因此隨著胚胎的發(fā)育其吸收率也隨之降低; 另一方面, 隨著胚胎內(nèi)Cr6+的累積, 重金屬的生物毒性會導致胚胎內(nèi)的生命活動減弱直至停止, 相應的胚胎對Cr6+的吸收率也隨之降低。

3.2 六價鉻暴露影響了斜帶石斑魚胚胎胰島素樣生長因子

igf2基因是胚胎發(fā)育的促進因子[13]。斜帶石斑魚桑葚胚期、囊胚期、原腸末期和腦泡形成期胚胎在低濃度(0.2—5 mg/L)Cr6+暴露下,igf2基因mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。生長激素會影響棕點石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)中的igf2基因水平, 低濃度1和10 nmol/L促進igf2 mRNA顯著高于高濃度100 nmol/L處理組[25]。在石斑魚胚胎心臟形成期,igf2基因mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)。我們推測Cr6+對石斑魚胚胎igf2基因mRNA表達具有劑量效應, 即低劑量Cr6+短時間暴露刺激而高劑量以及長時間暴露則抑制該基因在胚胎發(fā)育期間的表達。在本次實驗結(jié)束后不同保留濃度的孵化率也間接驗證了這一推斷。在實驗結(jié)束時, 經(jīng)過28h的孵化對照組及低濃度暴露組(0.2、0.6、1和5 mg/L)胚胎全部孵化成仔魚,而高濃度組(10、20、40和80 mg/L)胚胎孵化率極低(<30%), 說明高濃度Cr6+暴露嚴重阻礙了石斑魚的胚胎發(fā)育。因此從本實驗igf2基因表達的結(jié)果來看, 高濃度Cr6+(10—80 mg/L)暴露會抑制斜帶石斑魚胚胎igf2基因mRNA表達進而延長胚胎發(fā)育時間。

3.3 六價鉻暴露影響了斜帶石斑魚胚胎發(fā)育營養(yǎng)物質(zhì)的代謝

glut2基因能促進葡萄糖轉(zhuǎn)運效率, 該基因表達量主要受激素水平, 饑餓及脅迫水平[26]的影響。比如武昌魚(Megalobrama amblycephala)饑餓4d后,glut2基因的mRNA的表達水平高于饑餓1d和2d的表達水平[27]。本研究發(fā)現(xiàn)在中低濃度Cr6+(0.2—5 mg/L)暴露下, 石斑魚胚胎發(fā)育期間暴露在glut2基因mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05), 特別是濃度為1 mg/L的Cr6+暴露下,glut2基因的mRNA的水平在整個胚胎發(fā)育過程中幾乎是最高的, 說明低濃度Cr6+暴露能刺激glut2基因mRNA的表達水平。這可能是由于低劑量Cr6+誘發(fā)的細胞內(nèi)抗氧化等解毒反應額外增加了細胞的能量消耗, 進而刺激glut2基因增加表達以提供更多能量。

激素會干擾pparg基因在各種生物中的調(diào)節(jié)功能[28]。Cr6+是一種“金屬雌激素”[29], 在河鱒(Salmo trutta fario)幼魚中分離的原代肝細胞暴露在不同濃度的雌二醇和睪酮中, 發(fā)現(xiàn)低濃度的雌二醇會干擾pparg基因的mRNA的表達水平, 而高濃度的睪酮也會干擾pparg基因的mRNA的表達水平[30]。在本研究中, 低濃度的Cr6+暴露會刺激原腸末期和腦泡形成期的石斑魚胚胎pparg基因的mRNA的表達水平。這有可能是由于重金屬污染對魚類胚胎發(fā)育器官形成期前的影響最大[31], 所以在斜帶石斑魚胚胎的原腸末期和腦泡形成期時低濃度的Cr6+暴露,刺激了pparg基因的mRNA的表達來抵御由Cr6+引起的應激反應。

4 結(jié)論

為探討斜帶石斑魚胚胎發(fā)育不同時期在水相中Cr6+的暴露, 對其生物累積量、吸收率、細胞生長基因igf2、營養(yǎng)水平基因glut2和pparg的mRNA水平的影響。本研究發(fā)現(xiàn)Cr6+生物累積量和吸收率不僅隨暴露濃度的增加呈線性增加, 還延長了胚胎孵化時間。相比其他胚胎發(fā)育時期, 桑葚期吸收水中Cr6+最強。在轉(zhuǎn)錄水平上我們發(fā)現(xiàn)igf2、glut2和pparg基因在濃度為0.2、0.60、1和5 mg/L的Cr6+暴露下, mRNA的表達水平更顯著。我們推測低濃度的0.2、0.60、1和5 mg/L的Cr6+暴露就能引起石斑魚胚胎在細胞生長水平和營養(yǎng)代謝水平的干擾作用。