馬杰 屈雯 陳春艷 王磊 馬維 劉針杉 馬俊 楊珊 丁麗 高強(qiáng) 孫勃

摘要：利用羊肚菌（Morchella spp.）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR（表達(dá)序列標(biāo)簽-簡單重復(fù)序列）標(biāo)記，并對33份羊肚菌材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序共獲得73 781條Unigene序列，其中25 461條Unigene序列中含有41 814個簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats， SSR）位點(diǎn)，SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率為34.51%，平均分布距離為2.51 kb。優(yōu)勢重復(fù)序列類型為單核苷酸，占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的51.39%，其次為三核苷酸和二核苷酸，分別占總SSR位點(diǎn)數(shù)量的28.04%和13.35%。A/T、AG/TC、AGC/TCG分別是單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)基元。以33份羊肚菌和1份酵母菌為材料，從61對SSR引物中篩選出15對多態(tài)性引物，經(jīng)擴(kuò)增得到130條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為100%。遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，平均每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）為4.866 7個，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為2.124 2個，平均多樣性指數(shù)（I）為0.958 3，平均觀察雜合度（Ho）為0.191 1，平均期望雜合度（He）為0.495 1，平均Neis基因多樣性指數(shù)為0.483 5，表明篩選出的15對SSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有較好的遺傳多樣性。通過非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA）聚類分析，可將33份羊肚菌材料分為4類。試驗結(jié)果可為羊肚菌的種質(zhì)資源鑒定、品種鑒別和分子標(biāo)記輔助育種等研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：羊肚菌;分子標(biāo)記;EST-SSR;轉(zhuǎn)錄組;遺傳多樣性

中圖分類號：S646.701文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1282-09

Abstract：Expressed sequence tag-simple sequence repeat （EST-SSR） markers were developed using transcriptome data of Morchella spp.， and the genetic diversities of 33 varieties of Morchella spp. were analyzed. The results showed that a total of 73 781 Unigene sequences were obtained using transcriptome sequencing. There were 41 814 simple sequence repeats （SSR） loci in 25 461 Unigene sequences， the occurrence frequency of SSR locus was 34.51%， the average distribution distance was 2.51 kb. Single nucleotide was the advantage repetitive sequence type， which accounted for 51.39% of the total SSR loci， followed by tri-nucleotides and di-nucleotides， which accounted for 28.04% and 13.35%， respectively. A/T， AG/TC， AGC/TCG were the predominant repetitive motifs in single nucleotides， di-nucleotides， tri-nucleotides， respectively. 15 pairs of polymorphic primers were selected from 61 pairs of SSR primers， using 33 varieties of Morchella spp. and one variety of yeast as material. 130 polymorphic bands were obtained through amplification， with a polymorphic rate of 100%. Results of genetic diversity analysis showed that the average number of alleles （Na） was 4.866 7， the average number of effective alleles （Ne） was 2.124 2， the average diversity index （I） was 0.958 3， the average observed heterozygosity （Ho） was 0.191 1， the average expected heterozygosity （He） was 0.495 1， and the average Neis gene diversity index was 0.483 5， indicating that the amplified products of the selected 15 pairs of SSR primers had a good genetic diversity. 33 varieties of Morchella spp. could be divided into four groups by unweighted pair-group method with arithmetic means （UPGMA） cluster analysis. The results can provide basis for germplasm resources identification， variety identification and molecular marker assisted breeding of Morchella spp.

Key words：Morchella spp.;molecular marker;expressed sequence tag-simple sequence repeats （EST-SSR）;transcriptome;genetic diversity

羊肚菌（Morchella spp.）屬于子囊菌門（Ascomycata），盤菌綱（Pezizomycetes），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌屬（Morchella），由于其菌蓋表面凹凸不平，形如羊肚，故名羊肚菌[1]。羊肚菌肉質(zhì)脆嫩、風(fēng)味獨(dú)特、味道鮮美、營養(yǎng)豐富[2]，在全球范圍內(nèi)主要分布在法國、德國、美國、印度、中國等地，在中國主要分布在中西部地區(qū)，如貴州、云南、四川等地。

簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat， SSR），又稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），是一類由16個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列[3]。SSR因具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、易檢測、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]而被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析[5]、遺傳圖譜構(gòu)建[6]及親緣關(guān)系研究[7]等領(lǐng)域。根據(jù)SSR的來源不同，可以將其分為基因組SSR和EST（Expressed sequence tag，EST，表達(dá)序列標(biāo)簽）-SSR兩大類型，與基因組SSR標(biāo)記相比，由于EST-SSR是基于EST序列開發(fā)的，來源于表達(dá)的基因組區(qū)域，可以直接反映相關(guān)基因的多樣性，因而在不同物種之間具有良好的通用性[8-10]。此外，由于轉(zhuǎn)錄組序列多集中在功能基因上，因此基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR標(biāo)記有利于后期與重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而為分子標(biāo)記輔助育種節(jié)約時間和成本。

目前，EST-SSR在蔬菜[7]、果樹[11]、花卉[12]等許多植物中都有應(yīng)用，但尚未見將其應(yīng)用于羊肚菌的相關(guān)報道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)出羊肚菌EST-SSR標(biāo)記，并對其多樣性進(jìn)行分析，旨在篩選適合羊肚菌SSR標(biāo)記分析的核心引物，為羊肚菌種質(zhì)資源遺傳多樣性評價和親緣關(guān)系分析提供引物。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗采集了33份羊肚菌材料和1份酵母菌材料作為提取DNA模板的原材料，材料的相關(guān)信息見表1。

1.2試驗方法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組測序采集不同品種羊肚菌的各組織，進(jìn)行等量混合后送至北京諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2基因組DNA的提取采集各個材料樣品，用液氮冷凍后研磨，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取樣品的基因組DNA[13]，并于-20 ℃儲存?zhèn)溆?，?.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.2.3引物設(shè)計與合成采用MISA軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對羊肚菌轉(zhuǎn)錄組的Unigene基因進(jìn)行搜索。分別設(shè)定單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重復(fù)搜索次數(shù)為10次、6次、5次、5次、5次、5次。用Primer 3進(jìn)行引物設(shè)計，引物序列長度為18～27 bp，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100～300 bp，G+C含量為40%～60%，退火溫度為54～61 ℃。隨機(jī)挑選出設(shè)計的61對引物送至生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司進(jìn)行合成。

1.2.4PCR擴(kuò)增及檢測20 μl PCR反應(yīng)體系如下：1 μl DNA模板，10 μl 2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE，各1 μl上游、下游引物，用去離子水補(bǔ)足體積至20 μl。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性10 s，49～54 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，32個循環(huán);72 ℃延伸10 min。初篩用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，復(fù)篩用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用人工讀帶的方法，將聚丙烯酰胺凝膠電泳圖上可重復(fù)的清晰條帶的記為“1”，在同一位置條帶較弱或無條帶的記為“0”，由此建立原始數(shù)據(jù)矩陣。用POPGENE 1.31和PIC-CALC軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性分析，用NTSYS-PC 1.0軟件進(jìn)行供試材料的聚類分析。

2結(jié)果與分析

2.1羊肚菌轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的分布及特點(diǎn)

通過對羊肚菌的73 781條Unigene序列（總長度約為104 910 kb）進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)，在25 461條Unigene序列中含有41 814個SSR位點(diǎn)，其中7 306條Unigene含有2個或2個以上SSR位點(diǎn)。整體上看，SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率為34.51%，即平均每2.51 kb出現(xiàn)1個SSR。單核苷酸重復(fù)是主要類型，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的51.39%;其次是二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)，分別占總SSR位點(diǎn)數(shù)的13.35%、28.04%;四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總SSR位點(diǎn)數(shù)的4.56%、1.10%和1.56%。在所有SSR位點(diǎn)中，重復(fù)10次的SSR位點(diǎn)數(shù)最多，共有6 658個，占總數(shù)的15.92%;重復(fù)5次的SSR位點(diǎn)數(shù)次之，共有6 396個，占總數(shù)的15.30%;重復(fù)6次的SSR位點(diǎn)共有5 426個，占總數(shù)的12.98%（表2）。

羊肚菌的平均SSR位點(diǎn)長度為18.63 bp，其中六核苷酸重復(fù)序列的平均長度最長，達(dá)到38.94 bp。羊肚菌的SSR長度范圍為5～114 bp，其中長度為5～10 bp的重復(fù)序列數(shù)最多，共有24 377個，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的58.30%;長度為11～20 bp的重復(fù)序列數(shù)次之，共有12 313個，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的29.45%;長度大于40 bp的重復(fù)序列數(shù)最少，僅占總SSR位點(diǎn)數(shù)的2.17%（圖1）。

在本試驗中，利用15對SSR引物對來自7個省份的33份羊肚菌材料和1份酵母菌材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶的多態(tài)性比例為100.0%，高于黑木耳（95.5%）[24]、野生香菇（95.9%）[25]、真姬菇（81.2%）[26]。15對SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，這些羊肚菌材料具有豐富的遺傳多樣性。徐銳[25]利用34對高多態(tài)性引物對94個香菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，I、Ho、PIC的平均值分別是0.89、0.24、0.40。張躍新等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳SSR標(biāo)記的平均PIC、I分別為0.216、0.455，這些結(jié)果都略低于本試驗結(jié)果，表明本試驗開發(fā)的羊肚菌的SSR多態(tài)性較好。一些真菌的遺傳多樣性高于本試驗結(jié)果，如灰樹花的平均PIC為0.52[15]，金針菇的平均PIC為0.801 9[21]，這些現(xiàn)象可能與物種的差異有關(guān)。本研究通過對33份羊肚菌材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果共分為4大類，來自貴州畢節(jié)的11個材料在這4類中均有分布，說明這些來自貴州畢節(jié)的羊肚菌材料受所在地區(qū)羊肚菌基因滲透的影響較小。而來自云南昆明、貴州貴陽和四川成都的大部分材料都各自聚類在同一小組，說明這些材料在區(qū)域內(nèi)沒有發(fā)生明顯的遺傳分化，由此表明聚類分析結(jié)果與地理位置有一定關(guān)系。

4結(jié)論

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)成功開發(fā)了羊肚菌SSR位點(diǎn)，共篩選獲得15對核心引物，并將其成功應(yīng)用于33個羊肚菌的遺傳多樣性和聚類分析中。研究結(jié)果豐富了羊肚菌EST-SSR標(biāo)記引物庫，為今后羊肚菌的種質(zhì)資源鑒定、物種鑒別、分子標(biāo)記輔助育種、親緣關(guān)系分析等研究提供了引物支持和實(shí)踐參考。

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（責(zé)任編輯：徐艷）