尹大芳,孫曉杰,郭瑩瑩,彭吉星,王婧媛,李 娜,王聯(lián)珠,*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

多糖的生理活性越來越受到關(guān)注,已被發(fā)現(xiàn)在降血脂[1]、抗氧化[2]、抗凝血[3]、抗病毒[4]、抗貧血[5]和神經(jīng)保護作用[6]等方面具有顯著功效[7]。多糖可分為同多糖和雜多糖,自然界存在的多糖通常為雜多糖,由多種單糖聚合而成。單糖組成對多糖生物活性具有重要影響,單糖組成是評價多糖理化性質(zhì)的第一步,是糖類研究必不可少的一個環(huán)節(jié)。單糖極性大、無紫外和熒光特性,種類多樣,結(jié)構(gòu)相似,具有同分異構(gòu)體;因此,多糖中單糖分離及定量分析極具挑戰(zhàn),成為制約糖類生物活性及應用研究的瓶頸[8]。

表1 無需衍生化的檢測器的優(yōu)缺點

早期,單糖的定量測定方法有容量法、旋光法和比色法(苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和地衣酚法)等,該類方法缺乏專屬性,僅能用于總糖量的測定[9]。隨后,紙層析法和薄層色譜法應用到單糖的定性定量檢測,該類色譜法只能實現(xiàn)單糖的半定量分析,靈敏度和分離度差,只適用于單糖組成相對簡單的多糖的定性分析[10]。近年來,上述方法已逐步被高效液相色譜法、氣相色譜法、高效陰離子色譜法和毛細管電泳法等方法所取代,極大提高了單糖定性定量分析方法的準確性。高效液相色譜儀在實驗室較為普及,因此,高效液相色譜法應用最為廣泛。氣相色譜法的局限之處在于單糖的檢測需要衍生化處理,使其具有足夠的揮發(fā)性,衍生化過程操作繁瑣[11]。毛細管電泳和高效陰離子色譜法為單糖的高效分離提供了強有力的工具,在單糖的定性定量分析中極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本文針對單糖的分離和定性定量的常用分析方法(液相色譜法、氣相色譜法、毛細管電泳法和高效陰離子交換色譜法)進行文獻綜述以及分析評述,以期為多糖中單糖組成的檢測技術(shù)的建立提供理論參考。

1 高效液相色譜

高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)是利用混合物內(nèi)各組分特定的理化性質(zhì)(極性、相對分子質(zhì)量等)在兩相(流動相和固定相)之間分配系數(shù)的差別,從而使各組份得到分離,傳送到檢測器進行檢測。HPLC耦合的檢測器根據(jù)是否需要對單糖進行衍生化可分為兩種,即需衍生化的檢測器和無需衍生化的檢測器。

1.1 無需衍生化的檢測器

無需對單糖衍生化便可直接檢測的檢測器有示差折光檢測器(refractive index detector,RID)、蒸發(fā)光散射檢測器(evaporative light scattering detector,ELSD)、荷電氣溶膠檢測器(charged aerosol detection,CAD)以及質(zhì)譜檢測器(mass spectrometer,MS);此種檢測器不需要柱前柱后衍生便可完成單糖的檢測,具有操作簡便,節(jié)省時間等優(yōu)點。表1為HPLC常用無需衍生化檢測器的優(yōu)缺點。

1.1.1 色譜柱類型及特點 由于糖類具有親水性,未衍生的糖類不可通過普通反相色譜柱實現(xiàn)對單糖的分離[15]。目前,應用于未衍生-HPLC的分離常用色譜柱有:糖基柱、氨基柱、酰胺柱。該類色譜柱柱穩(wěn)定性、壽命以及分離重現(xiàn)性等方面不佳[12]。其中,酰胺柱比氨基柱的穩(wěn)定性更高,壽命更長;酰胺柱的梯度兼容性更高,能夠排除鹽分的干擾,減少溶劑消耗而被廣泛應用[16]。

1.1.2 示差折光檢測器 HPLC-RID操作簡便、快速,應用較為廣泛,《食品安全國家標準 蜂蜜》[17]和《中國藥典》[18]均采用HPLC-RID測定蜂蜜中的單糖和二糖,《中國藥典》中許多單糖的測定也采用該法。Filip等[19]利用HPLC-RID經(jīng)Carbosep Coregel 87H3 column色譜柱對蘋果的葉片和蘋果皮中葡萄糖、果糖、蔗糖和山梨糖等4種糖類化合物進行分離檢測,其線性關(guān)系良好(R2>0.99),檢出限為2.67～4.83 mg/L,定量限為8.9～16.1 mg/L,RSD<5.05%,回收率為93.94%～103.06%。RID的檢出限高,靈敏度低;受溫度影響大,需保持恒溫,微小的溫度波動也會引起響應值的巨大波動[15]。RID與流動相濃度的波動緊密相關(guān),使用梯度洗脫時會發(fā)生基線漂移,影響單糖定量的準確度[20]。RID作為檢測器時,不可使用梯度洗脫,而單糖分離過程中,等度洗脫很難將復雜的單糖混合物進行分離,使單糖分離效果受到限制。

1.1.3 蒸發(fā)光散射檢測器 HPLC-ELSD對溫度波動不敏感[21],逆梯度洗脫可使ELSD響應值不受洗脫劑梯度影響,ELSD可使用梯度洗脫[8]。HPLC-ELSD通過對洗脫劑蒸發(fā),從而達到對不易揮發(fā)的物質(zhì)進行檢測的方法,需要洗脫劑具有較低的沸點,以使洗脫劑容易蒸發(fā),防止糖類的熱降解[21-22]。Ma等[23]對桃子、蘋果、西瓜和櫻桃等4種水果研磨取汁過濾膜后,直接進樣,利用HPLC-ELSD經(jīng)氨基柱分離對果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖4種糖類進行檢測,在1～3000 mg/L線性范圍內(nèi)，決定系數(shù)R2為0.9934～0.9978,檢出限和定量限分別為0.07～0.27 mg/L和0.22～0.91 mg/L,方法回收率為96.05%～103.32%。吳曉鵬等[24]利用HPLC-ELSD經(jīng)Xbridge-NH2色譜柱分離測定木薯中的果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖,檢出限為4.00～7.00 mg/L,靈敏度相對較低。ELSD的局限之處在于檢測靈敏度相對較低,對于相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)線性關(guān)系較差。

1.1.4 荷電氣溶膠檢測器 CAD又稱為電霧式檢測器,是以粒子的質(zhì)量為基準,具有普遍適用性。相對于RID和ELSD,具有更高的檢測靈敏度及更低的檢出限。Yan等[25]利用HPLC-CAD經(jīng)BEH amide column分離檢測植物中的鼠李糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等8種單糖,該方法線性關(guān)系良好(R2≥0.9981),回收率為94.02%～103.37%,檢出限為15～40 ng。相比于RI和ELSD,CAD在靈敏度、線性關(guān)系、重復性和方法回收率等方面表現(xiàn)更佳。

表2 需衍生化檢測器的優(yōu)缺點

1.1.5 質(zhì)譜檢測器 MS具有快速、高效、準確的特點,在單糖結(jié)構(gòu)解析方面具有獨一無二的優(yōu)勢,是未來糖類結(jié)構(gòu)解析技術(shù)的發(fā)展方向。趙丹等[26]采用HPLC-MS經(jīng)Waters Acquity BEH Amide色譜柱測定螺旋藻多糖的單糖組成,鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、核糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等12種單糖的定量限在0.005～0.15 mg/L之間,回收率在80.21%～121.6%之間。王倩文等[27]利用HPLC-MS測定啤酒中果糖、葡萄糖的含量,果糖檢出限為0.05 mg/L,葡萄糖檢出限為0.49 mg/L,決定系數(shù)R2=0.9999。Wu等[28]采用PMP-HPLC/ESI-MS對食用馬尾藻多糖中單糖進行了分析,實現(xiàn)了對甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖五種單糖的快速、準確、經(jīng)濟的分離檢測,線性范圍在0.1～10 mg/L之間,檢出限在0.02 mg/L及以下。該方法樣品前處理簡單,準確度高,檢測靈敏度高,復現(xiàn)性高。但一些利用HPLC-MS檢測糖類的文獻中缺乏關(guān)于回收率的方法學驗證數(shù)據(jù),這可能是由于HPLC-MS的回收率較低。MS的局限之處在于單糖自身低電離度造成檢測的靈敏度低,復現(xiàn)性差,回收率差;另外,MS設(shè)備價格昂貴,操作技術(shù)要求高,需要熟練的分析人員,現(xiàn)階段應用推廣還較為困難。

1.2 需衍生化的檢測器

常用的需衍生化的檢測器有:紫外檢測器(ultra-violet detector,UV)和熒光檢測器(fluorescence detectors,FLD)。該檢測器通常具有準確可靠、靈敏度高的優(yōu)點,但也伴隨著操作繁瑣,浪費時間的不足。表2為HPLC常用需衍生化檢測器的優(yōu)缺點。

1.2.1 衍生化 糖類化合物缺乏發(fā)色團和熒光團(無紫外和熒光特性),單糖只吸附在190～210 nm區(qū)域,而HPLC常用的乙腈等有機流動相在此區(qū)域的吸附也較強,不能直接利用UV和FLD等對單糖進行檢測,需要對單糖進行衍生化使其具有更高的檢測靈敏度和更好地淋洗液梯度兼容性[8]。大部分糖類物質(zhì)呈現(xiàn)電中性、親水性,衍生化可使其變?yōu)閹щ姾傻摹⒁纂婋x的、疏水性強的衍生物,增加檢測器對其的檢測靈敏度[30]。例如:中性糖通過乙?；赊D(zhuǎn)化為電離態(tài)糖[21]。

單糖的衍生化反應根據(jù)衍生化的順序可分為柱前衍生化和柱后衍生化兩種[31]。柱后衍生需要額外的設(shè)備作為衍生池,成本高,應用較少。柱前衍生化常用試劑有對氨基苯甲酸(paminobenzoic acid,p-AMBA)、鄰氨基苯甲酸(o-aminobenzoic acid,OABA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP)等。柱前衍生化后的單糖可使用普通烷基鍵合的硅膠柱C8和C18色譜柱便可實現(xiàn)對單糖的分離。

目前,最常用的單糖衍生劑為PMP。PMP是目前應用最廣、適用性最高的單糖衍生劑[32],1989年[33]提出PMP衍生,PMP可使羰基上多兩個吡喃啉酮單元,使單糖帶有發(fā)色基團,它可以盡可能的減少色譜中雜峰的出現(xiàn),PMP衍生化過程與單糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有密切的關(guān)系,不同單糖由于其結(jié)構(gòu)不同會產(chǎn)生不同的衍生產(chǎn)物[32];PMP衍生化后單糖在245 nm具有強烈的吸收峰,檢出限低至μg/L,不需要對特定的單糖進行脫硫處理[34],該衍生物在4 ℃儲存期長達60 d[35]。PMP衍生化的不足在于其單糖種類的分析結(jié)果可能會不完整[36],果糖和其他非還原糖分子上的空間位阻或缺乏醛基所致,不能與PMP等典型的衍生化試劑發(fā)生反應產(chǎn)生發(fā)色基團,致使無法對果糖進行檢測,從而導致分析結(jié)果的不完整性[37]。

1.2.2 紫外檢測器 相比未衍生化的單糖檢測技術(shù),衍生化后的HPLC-UV檢測單糖的檢測靈敏度更高,檢出限更低,復現(xiàn)性更好。Bai等[38]利用HPLC-UV通過Agilent Eclipse XDB-C18column色譜柱分離檢測客家米酒中的寡糖和單糖組成,其回收率為93.13%～102.08%,RSD為0.96%～2.48%,檢出限為0.09～0.26 mg/L。UV檢測器的響應值取決于單糖的摩爾吸收能力,即使在相似的結(jié)構(gòu)單糖,其響應值大小也可能相差幾個數(shù)量級[14]。戴軍等[39]利用PMP-HPLC-UV經(jīng)ZORBAX Eclipse XDB-C18柱對杜氏鹽藻多糖的單糖組成進行分析,對8種中性糖、2種糖醛酸以及2種糖胺進行分離檢測,其分離單糖數(shù)量較多,取樣量少;但其單糖間的檢出限以及定量限的差距較大;衍生化操作耗時(需100 min)。此外,低波長紫外檢測器對淋洗液和樣品基體非常敏感,這也限制了梯度洗脫方法的使用[40]。

1.2.3 熒光檢測器 p-AMBA是FLD常用的衍生試劑,梁軍等[41]建立了p-AMBA-HPLC-FLD單糖檢測方法,其中8種單糖半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、鼠李糖的檢出限小于0.2 mg/L,線性關(guān)系良好。

衍生化后的單糖檢測技術(shù)往往提高了檢測的靈敏度、降低了檢出限和定量限,回收率較好,但是衍生化步驟繁瑣、耗時,衍生過程不可避免會引入雜質(zhì),以及后續(xù)衍生劑的清除均可造成檢測的誤差。

2 氣相色譜

氣相色譜(gas chromatography,GC)利用試樣中各組份在氣相和固定相間的吸附或溶解能力不同,進行反復多次分配,從而達到不同單糖間的分離。氣相色譜法具有靈敏度高、樣品用量少等優(yōu)點,適用于樣品含量較低(10-8～10-9)的多糖的單糖組分分析[42]。GC常耦合的檢測器有火焰電離檢測器(flame ionization detector,FID)和MS。

2.1 衍生化

由于單糖具有非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性,因此氣相色譜法檢測前需要衍生化,常通過衍生化以提高糖類物質(zhì)的揮發(fā)性以及揮發(fā)后的穩(wěn)定性,最常用的衍生化方法是硅烷化和乙?；痆30]。硅烷化衍生法具有反應條件溫和、操作簡單、節(jié)省時間的優(yōu)點,但容易產(chǎn)生副衍生物而造成多峰、重疊峰等現(xiàn)象,這給后續(xù)的定性工作帶來較大困難,造成定量不準確。Haas等[30]針對從甲醛、乙醇醛、醛酮類三糖到己糖、多元醇和糖醛酸等單糖的GC衍生化反應進行了比較,得出乙?；菃翁茄苌膬?yōu)選。乙酰化衍生法能有效減少由于糖的異構(gòu)化而造成的多峰現(xiàn)象,每種單糖都能獲得單一的色譜峰,有利于對單糖進行準確地定性和定量分析[43]。

2.2 火焰電離檢測器和質(zhì)譜檢測器

司雄元等[44]利用乙?；?GC-FID對經(jīng)DB-5色譜柱分離的三氟乙酸水解的微生物多糖和植物多糖中的半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖6種單糖進行檢測,其線性關(guān)系為2.00～100.00 mg/L,檢出限均在0.11 mg/L以下。He等[45]利用乙?；?GC-FID對四種海藻多糖進行單糖檢測,分析出9種單糖,靈敏度、分離度較好,但果糖出現(xiàn)兩個色譜峰。楊彬君等[46]對糖腈乙酸酯衍生化后的牛樟芝多糖中單糖經(jīng)Agilent DB-WAX毛細管柱進行檢測,檢測出鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的峰面積的精確度RSD<1.76%,重現(xiàn)性的RSD<3.08%,該方法精確度和重現(xiàn)性良好。楊永晶等[43]利用乙?；?GC-MS,建立了鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7種單糖的檢測方法,并對樹莓多糖進行檢測,其線性范圍為25～400 mg/L,各種單糖的平均回收率分別在96.4%～101.4%,該檢測方法具有簡便靈敏,精密度高,衍生物穩(wěn)定,衍生雜質(zhì)少,回收率穩(wěn)定,重復性佳的優(yōu)點,具有較強的適用性。

2.3 氣相色譜法與高效液相色譜法的對比

有研究對比了GC和HPLC在單糖檢測中各自的優(yōu)缺點。例如:王瀟瑞等[47]對比了乙?；?GC-FID和PMP-HPLC分析石榴皮多糖的單糖組成方法,結(jié)果顯示,GC法操作繁瑣,試劑種類多、耗時長,不利于快速分析;PMP-HPLC相對操作簡單,衍生化的試劑種類少,耗時短,工作效率高;畢欣寧等[48]對比了PMP-HPLC-DAD和GC-FLD測定黃芪多糖的單糖組成,結(jié)果表明,兩種方法的專屬性、精密度和穩(wěn)定性都較好,重復性和加標回收率都較差,相對來說,PMP-HPLC的操作計算更為簡便,在單糖組成分析上更具優(yōu)勢,但是由于復雜的衍生過程會降低中性單糖的加標回收率。

3 毛細管電泳

毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)主要通過電場作用下的電泳遷移和緩沖溶液作用力下的電滲遷移來實現(xiàn)單糖的分離。利用緩沖溶液的電滲流使單糖通過對其具有不同保留程度的第二相,達到分離的目的。

3.1 毛細管電泳的種類

毛細管電泳的分離模式可分為毛細管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis,CZE)、毛細管凝膠電泳(capillary gel electrophoresis,CGE)、毛細管等速電泳(capillary isotacho phoresis,CITP)、毛細管等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)和膠束電動毛細管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC)等;耦合的檢測器有UV、PAD、MS和激光誘導熒光檢測器(laser Induced Fluorescence Detectors,LIFD)等。CE檢測單糖常用兩種模式:非衍生化的CE-UV檢測和衍生化-CZE-UV。

3.2 質(zhì)譜檢測器和紫外檢測器

Daniel等[49]利用CE-MS在12 min內(nèi)完成了對咖啡中巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖9種單糖的檢測,檢出限低至0.18 mg/L。張歡歡等[50]利用CZE-UV以磷酸鹽為分離緩沖體系,在10 min內(nèi)完成了對巧克力、蘋果醋、飲料沖劑等食品中4種糖類化合物(乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖)的快速檢測,其靈敏度低,檢出限分別為50、75、25和25 mg/L,定量限分別為150、225、75和75 mg/L,回收率在87.0%～107.0%之間。馬海寧等[51]以對甲氧基苯胺為衍生試劑,采用CZE-UV分析了藏紅花植物細胞多糖中的單糖組成,基線分離了11種結(jié)構(gòu)相近的醛糖(來蘇糖、木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、纖維二糖、麥芽糖、乳糖)、酮糖(果糖)的衍生產(chǎn)物,該方法分離度好,適用于結(jié)構(gòu)復雜的多糖中單糖組成的測定,各單糖的回收率在為94.3%～105.4%,檢出限低至0.1 μmol/L。Rovio等[52]采用CZE-UV同時分離了檸檬、菠蘿,橙子等水果中的木糖醇、甘露醇、蔗糖、巖藻糖、纖維二糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖12種糖類化合物,其檢出限為5 mg/L。

相對于HPLC,HPCE利用極細的色譜柱作為分離柱,分離度高、效率高,是一種具有潛力的單糖檢測技術(shù),它僅需要微量的緩沖液、有機溶劑,具有經(jīng)濟性、高效性,以較HPLC快2～3個數(shù)量級的分離效率而應用于復雜多糖的分析,大大縮短了分析時間[8]。但是CE色譜柱的極低內(nèi)徑以及極低的樣品注射量[53],導致CE具有較低的檢測靈敏性,較低的重復性。

表3 常用糖類分析柱的類型及其特點

4 高效陰離子交換色譜

高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)是一種強大的分析單糖組成工具,嚴格來講,高效陰離子交換色譜法屬于高效液相色譜法的一種。相對于HPLC,HPAEC更適合于極性強、無吸光基團的糖類化合物的檢測。HPAEC利用單糖具有潛在的可電離羥基,在強堿性條件下呈現(xiàn)陰離子狀態(tài),根據(jù)電離的單糖所帶電荷、疏水吸附性作用,分子量大小的不同實現(xiàn)單糖的分離。HPAEC常耦合脈沖安培檢測器(pulsed ampere detection,PAD)為檢測器,利用糖在電極表面的氧化還原反應來對單糖進行檢測,結(jié)合固定相色譜柱的多選擇性,無需衍生且具有極高的靈敏度;利用不同相對分子質(zhì)量的低聚寡糖之間羥基解離度的稀薄差異實現(xiàn)他們的精細分離,使得幾乎所有類別的醛糖醇、氨基糖、寡糖的混合物可以達到良好的分離效果。此外,其靈敏度低至μg/L,適合于單糖含量低的物質(zhì)的檢測,適用于糖類含量較少的樣品的檢測,為在常規(guī)檢測器中響應很低的單糖分析提供了方法[54]。

4.1 常用色譜柱類型

HPAEC-PAD對糖類分離效果與色譜柱選擇密切相關(guān),不同類型糖的分離需選擇相應色譜柱。例如:木糖與甘露糖以及阿拉伯糖和鼠李糖屬于兩對差向異構(gòu)體,需要特定的糖柱結(jié)合適當流動相條件將其分離,CarborPac PA1為其分離提供了良好的條件。表3為HPAEC常用的分析柱的類型及其特點。

4.2 色譜條件對分離度的影響

HPAEC的分離條件對單糖的分離具有決定性的作用。HPAEC-PAD常以強堿性溶液(如:NaOH,KOH等)作為流動相,在同樣的色譜柱的前提下,洗脫劑的濃度是影響糖類分離的首要原因,10～20 mmol/L NaOH對單糖進行洗脫分離常能達到很好的效果。Xie等[63]利用CarboPac PA10柱結(jié)合12.5 mmol/L NaOH作為流動相對青錢柳多糖中單糖進行檢測,一次進樣在20 min內(nèi)快速分離了8種單糖(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖),其檢出限在2.57～7.86 mg/L之間、重現(xiàn)性在98.53%～102.13%之間,加標回收率在94.34%～105.69%之間。

流動相的流速是決定HPAEC分離度的另一重要因素,較低的流速會提高分子擴散,色譜峰展寬,峰型變矮,保留時間和分析時間增長,但是高流速會使系統(tǒng)壓力升高,分離度降低[69]。溫度很小的變化(±5 ℃)可能引起單糖的保留時間的遷移以及單糖保留時間復現(xiàn)性的降低[70-71]。溫度對分離度的影響因單糖種類不同而各異,例如:高溫(40～50 ℃)是分解木糖和甘露糖的優(yōu)選條件,而低溫(20～25 ℃)條件下,阿拉伯糖和鼠李糖的分離效果更好[64]。溫度的升高可以提高分離速度,但同時也會增大色譜峰寬[64]。HPAEC常用溫度為20～30 ℃。

4.3 HPAEC-PAD的相關(guān)應用

潘丙珍等[59]利用HPAEC-PAD建立了烘焙咖啡豆及其摻假物中糖類標記物甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖的檢測方法,7種糖在50 min內(nèi)實現(xiàn)完全分離,分離度達到1.5以上,甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖在0.5～30 mg/L濃度范圍內(nèi),木糖、甘露糖、果糖在1.0～30 mg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性,相關(guān)系數(shù)在0.9990～0.9999之間;方法準確度和精密度良好,加標回收率在86.0%～101.0%之間,相對標準偏差(RSD)均小于5.0%。

劉芬等[72]利用HPAEC-PAD檢測海參多糖中單糖組成,檢測出9種單糖(巖藻糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖和葡萄糖等),線性范圍在0.25～50 mg/L,決定系數(shù)R2≥0.998,檢出限為2.5～50 μg/L,加標回收率為83.65%～113.1%。楊潔等[73]采用CE對海參多糖中單糖組成進行檢測,檢測出9種單糖(氨基半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖等),線性范圍在0.5～10.0 mg/mL之間,決定系數(shù)R2≥0.982。同樣針對海參多糖的單糖組成進行檢測,相比之下,HPAEC可檢測的濃度范圍更大,且相關(guān)系數(shù)更高,檢出限更低,靈敏度更高;CE檢測的文獻報道中未顯示回收率的相關(guān)指標,可能是由于其回收率低。

Zhang等[54]對比了HPLC-ELSD、HPLC-RID和HPAEC-PAD三種方法對黃芪多糖中單糖含量的測定,發(fā)現(xiàn)ELSD和RID檢測都不太理想,而HPAEC-PAD的回收率在97.83～102.05%之間,檢出限達到μg/L,在阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和纖維二糖的檢測定量中具有高精度、高準確度、高靈敏度。畢欣寧等[48]同樣對黃芪多糖中的單糖組成進行檢測,其中GC-FLD的精密度良好(RSD<0.06%),重復性好(RSD<7.21%),加樣回收率為106.3%～131.0%;HPLC的精密度良好(RSD<3.27%),重復性好(RSD<10.85%),加樣回收率為69.3%～204.1%。GC和HPLC需對單糖進行衍生化,操作繁瑣;而HPAEC無需衍生前處理簡便,在精密度,重復性、檢出限和回收率等方法學驗證指標下更具優(yōu)勢。

4.4 不足和改進

HPAEC在單糖檢測方面也有其局限之處,主要表現(xiàn)以下四個方面:a. HPAEC檢測常用NaOH溶液作為洗脫液,而NaOH容易與環(huán)境中CO2反應生成NaCO3,碳酸根屬于強堿性二價陰離子,易與色譜柱中陰離子交換體結(jié)合,干擾碳水化合物的保留,導致保留時間縮短,柱選擇性降低,分辨率降低。解決這一問題可從兩個方向出發(fā):一是盡可能的減少NaOH溶液受空氣中CO2的影響,即充氮氣保護;二是改變洗脫劑的耐受程度,即將易受碳酸鹽影響的洗脫劑換為不易受碳酸鹽干擾影響的KOH或向其中加入NaN3、鋇和鍶等可以沉淀碳酸鹽的物質(zhì)。Cataldi等[74]提出了鋇離子和鍶離子加入堿性洗脫液以降低二氧化碳的吸收。b. 早期使用三電位波形,單糖在金電極表面會發(fā)生氧化還原反應,造成單糖在電極表面的堆積產(chǎn)生不可逆污染,致使電極表面容易腐蝕[55],1998年提出使用四電位波形成功解決了這一問題,提高了檢測器的重現(xiàn)性[75]。c. HPAEC需要樣品不含有污染色譜柱的脂肪、陰離子洗滌劑以及強疏水性的有機化合物;不含會發(fā)生電化學干擾的強氧化還原性化合物[55]。d. HPAEC檢測單糖時,一針樣品運行完成后,色譜柱需要重新活化平衡后再對下一針樣品進行檢測,否則會出現(xiàn)下一針樣品的出峰時間前飄的現(xiàn)象[76]。需要利用強洗脫陰離子(eg:NO3-、SO4-、AC-)進行柱后活化,由于NO3-、SO4-與固定相陰離子交換色譜柱具有強交換能力,會導致陰離子柱的容量下降,因此常使用NaAc作為柱活化劑,柱后使用NaAc作為活化劑可以提高單糖檢測的靈敏性和復現(xiàn)性[77]。

5 結(jié)語

單糖分離技術(shù)快速發(fā)展,現(xiàn)階段應用最廣的單糖定量色譜技術(shù)為HPLC,高效液相色譜儀屬實驗室的基本儀器,適合于大范圍推廣,但其耦合的不同檢測器都有其各自的優(yōu)缺點。HPLC-RID無需衍生,操作簡便,不可使用梯度洗脫,且受溫度影響大,單糖的分離度達不到保障;HPLC-ELSD允許梯度洗脫,但存在檢測靈敏度低的問題,相對分子質(zhì)量小的糖類的線性關(guān)系不好;衍生化的HPLC-UV提升了檢測方法的靈敏度,在靈敏度、復現(xiàn)性、線性關(guān)系中更具優(yōu)勢。但是衍生操作繁瑣、浪費時間,且衍生可能會帶入雜質(zhì),衍生試劑的清除以及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性為衍生化后續(xù)一系列問題。GC適合于復雜糖類化合物的檢測,分離速度快,效率高,但是GC檢測單糖需采用多種衍生試劑來完成單糖的衍生化過程,操作相當繁瑣,且回收率低;其次,衍生產(chǎn)物常伴隨著重現(xiàn)性低的特點,由于單糖具有差向異構(gòu)體,在堿性條件下,會發(fā)生酮式和烯醇式的互換,從而造成多峰的出現(xiàn),干擾單糖檢測定量。MS在糖類結(jié)構(gòu)解析方面具有獨特優(yōu)勢,但是靈敏度和回收率均不佳。CE分辨率高,速度快,是一種具有潛力的單糖檢測技術(shù),僅需要微升級的緩沖液、有機溶劑以及添加劑,無需衍生分離效率高,適合于復雜樣品的分離,但是由于CE使用極低內(nèi)徑的色譜柱檢測糖類,進樣量小,靈敏度低,不適用于含量少的樣品檢測。HPAEC-PAD屬于HPLC的一種,適用于普通食品工業(yè)中的糖類檢測的應用中,具有分析時間短、效率高、靈敏度高、檢出限低、回收率高、樣品前處理簡單等優(yōu)點,在未來單糖檢測具有良好的應用前景,有望發(fā)展成為標準化的糖類檢測技術(shù)。隨著科學理論的不斷發(fā)展,研究工作的不斷深入,將會有更多、更有效的單糖組成檢測方法逐步走向標準化。