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淫羊藿苷對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠TNF-α、IL-6、IL-8、NF-kB和磷酸化NF-kB水平的影響

2020-12-09 10:25曹保利李棣華劉俊紅呂沅珊
關(guān)鍵詞:磷酸化異位低劑量

王 平,曹保利,李棣華,楊 磊,劉 帥,曹 穎,劉俊紅,呂沅珊

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300100;2.天津南開醫(yī)院婦產(chǎn)科)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是生育期婦女常見疾病,是一種良性的婦科疾病,以具有活性的子宮內(nèi)膜異位在子宮以外的其它地方為特征,是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病,常引起痛經(jīng)、盆腔炎癥和不孕等并發(fā)癥。臨床上約有10%~15%的生育期婦女患有此疾病,而不孕的婦女中有20%-40%的女性患有EMs,是一種需要終身治療的慢性疾病[1~3]。雖然EMs是一種良性的婦科疾病,但以惡性腫瘤的方式存在,對女性的健康產(chǎn)生重大的威脅[4]。目前,臨床上治療EMs的藥物并不是很理想,對EMs的治療還處在探索階段。淫羊藿苷(icariin,ICA)是中草藥淫羊藿的提取物,其具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[5],相關(guān)研究表明,淫羊藿有雌激素樣作用,可以提高去卵巢大鼠的骨密度與骨重量[6]。本文目的是探討淫羊藿苷對EMs大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8和NF-kB和p-NF-kBp65水平的影響,為EMs的治療提供新的理論依據(jù)。

1 研究材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 淫羊藿苷,規(guī)格:20mg,中國生物制品檢定所,批號110737-201415;硫酸慶大霉素注射液,華中藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H42021503;10%水合氯醛(0.3mL/100g體重),天津市南開醫(yī)院分子生物研究實驗室提供;10%福爾馬林溶液,天津市南開醫(yī)院病理實驗室;無菌PBS緩沖液,購自中奧天元生物有限公司;大鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)、大鼠白細(xì)胞介素-8(IL-8)、大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的酶鏈免疫吸附測定法(ELISA)試劑盒,均購自上海康朗生物科技有限公司;小鼠抗人磷酸化核因子kB(Ser536)單克隆抗體,購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器 全自動脫水機(ASP300S,德國Leica公司)、病理石蠟包埋機(德國Leica公司)、切片機(德國Leica公司)、攤片機(德國Leica公司)、烤片機(德國Leica公司)、電熱恒溫水浴箱(型號DKB-600D,上海橫一科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))、電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號DHG-101 3型,上海昕儀儀器儀表有限公司)、研究型正置熒光顯微鏡(型號DM4000B,德國Leica公司,攝像頭為DFC500,圖像采集軟件為LAS V3.7)。多功能酶標(biāo)儀(型號varioskanflash3001,thermo fisher scientific公司)

1.1.3 實驗動物 清潔級健康未交配過的SD雌性大鼠30只(中國食品藥品檢定研究所,國家實驗動物質(zhì)量檢測中心,SCXK(京)2014-0013),體重180~220g,常規(guī)飼養(yǎng),室溫,自然光照。分籠飼養(yǎng),每籠6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。本實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心動物倫理委員會審批許可,審批號為TCM-LAEC2018026。

1.2 方法

1.2.1 大鼠EMs模型的建立及成模情況參考非動情期大鼠EMs模型的建立方法[7,8],30只雌性SD大鼠,經(jīng)腹腔注射10%的水合氯醛(0.3mL/100g)進行麻醉,待麻醉滿意后,將大鼠移至鼠板,固定其頭與四肢,暴露腹部,備皮,手術(shù)用阿爾碘消毒,鋪無菌孔巾,開腹,找到“Y”字形子宮,將大鼠右側(cè)子宮分離暴露,近卵巢約1cm處與右側(cè)子宮宮頸處兩端結(jié)扎,將子宮剪斷,長約2cm,迅速將剪下的組織放置于盛有0.9%生理鹽水的無菌培養(yǎng)皿中;在無菌培養(yǎng)皿中將多余的脂肪和結(jié)締組織剔除,沿系膜部位將組織縱行剪開,將組織剪成大小約4mm*4mm的內(nèi)膜組織片段2段;將子宮內(nèi)表面上皮與腹壁相貼合,左右兩側(cè)腹壁血管豐富處各縫一塊,用7-0帶針無損傷線將剪下來組織的四個角縫合在腹壁血管豐厚處上;用生理鹽水將腹腔沖洗干凈,然后在大鼠腹腔內(nèi)滴入用生理鹽水稀釋過的鹽酸慶大霉素注射液2~3mL預(yù)防感染,用4-0絲線關(guān)腹縫合,用苦味酸涂抹傷口,以防大鼠撕咬傷口;術(shù)后2只大鼠因腹腔感染死亡,其余28只均成模。

1.2.2 分組及給藥方法 隨機將大鼠分為4組:空白對照組,模型組,ICA高劑量組,ICA低劑量組,每組7只??瞻讓φ战M、模型組:15mL·kg-1d-1,ICA高劑量組:100mg·kg-1d-1,ICA低劑量組:50mg·kg-1d-1,連續(xù)給藥28天。

1.2.3 EMs標(biāo)本采集及處理連續(xù)灌胃給藥28天后,在末次給藥24h內(nèi),用10%的水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠,經(jīng)目內(nèi)眥靜脈采血1mL,開腹,剪取腹壁移植物,及空白組剪取子宮,每個組織在無菌PBS中沖洗樣本3次,盡量去除血液。用吸水紙將組織上液體盡量吸干。將該組織,分別切割3份,其中一份組織放入多聚甲醛/福爾馬林中離心管中,封口膜封口,待HE檢測,另外兩份放置-80℃冰箱過夜,轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存待其他檢測。

1.2.4 EMs組織HE染色 將固定在福爾馬林中的組織進行脫水,經(jīng)石蠟包埋好,準(zhǔn)備切片,將切片好的組織進行常規(guī)操作染色,最后用中性樹膠封片于光鏡下觀察組織變化。

1.2.5 ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量 將采取的靜脈血置于離心機,1000r,20min,離心,分離血清,-20℃保存,待檢用。采用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平,操作嚴(yán)格按照試劑盒所標(biāo)示的步驟進行。酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的光密度(OD)值,在加終止液15min內(nèi)進行檢測,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,將大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量進行計算,得出數(shù)值。

1.2.6 以免疫印跡法檢測異位內(nèi)膜組織中的NFkB和磷酸化NF-kB水平 將存于液氮罐中的內(nèi)膜異位組織取出,將組織樣品稱取適量,放置于液氮預(yù)冷的研缽中,在研缽中加液氮將樣品充分研磨至粉末。加入粉末4倍體積裂解緩沖液(8 M尿素,1%蛋白酶抑制劑和2 mM EDTA),超聲裂解。4℃,12000 g離心10 min,去除細(xì)胞碎片,將上清液置入新的離心管中,利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液,煮沸變性5~10min,制備SDSPAGE凝膠,電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉,依次孵育一抗、二抗,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。Image-ProPlus6.0軟件對其進行分析處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,x±s表示計量資料,多個樣本之間采用方差分析(P<0.05,P<0.01),表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)異癥組織病理學(xué)觀察

空白組光鏡下可見黏膜上皮完整,細(xì)胞呈柱狀,細(xì)胞分布均勻,腺體數(shù)量多且完整。模型組光鏡下可見宮內(nèi)膜腺體,子宮內(nèi)膜間質(zhì)及含鐵血黃素;移植物腺體增生,腺上皮呈高柱狀排列。淫羊藿苷高劑量組與淫羊藿苷低劑量組在光鏡下均可見移植組織內(nèi)膜粘膜上皮變薄,呈萎縮性改變,呈縫隙狀改變,移植組織內(nèi)膜腺體可見明顯減少,腺腔較模型組明顯變窄,腺上皮萎縮明顯,呈扁平狀或矮立方狀,間質(zhì)中有少量白細(xì)胞浸潤,部分異位組織腺上皮明顯被破壞甚至消失(見圖1~4)。

2.2 ICA對大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-8含量的影響

以模型組作為參照,空白組與之相比較,TNFα、IL-6、IL-8含量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。ICA低劑量組與高劑量組與之相比較,TNF-α、IL-6、IL-8含量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見表1)。

2.3 ICA對大鼠EMs組織中NF-kB和磷酸化NF-kB蛋白水平的影響

模型組作為參照,空白組與之相比較,磷酸化NF-kB表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。ICA低劑量組與ICA高劑量組與之相比較,磷酸化NF-kB表達(dá)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見表2,圖5)。

表1 ICA對大鼠血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6’ng×L-1)白細(xì)胞介素-8(IL-8’ng×L-1)和腫瘤壞死因子(TNF-a’ng×L-1)水平的影響(x±s,n)

表2 ICA對大鼠EMs模型異位內(nèi)膜組織中核因子kB(NF-kB)蛋白和磷酸化核因子kB(p-NF-kB)表達(dá)水平的影響

3 討論

EMs是婦科常見的疾病,是一種炎癥性、雌激素依賴性疾病,也是臨床上引發(fā)不孕的危險因素之一[9,10]。TNF-α、IL-6、IL-8都是重要的炎癥因子,對EMs的診斷具有一定的臨床意義[11]。相關(guān)研究表明IL-6可以作為炎癥早期的因子,促進其他炎癥因子的分泌,使炎癥反應(yīng)放大[12]。IL-8是通過巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌,可使中性粒細(xì)胞趨化,促使新的血管形成,在炎癥的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[13]。TNF-α在機體處于正常水平下其水平表現(xiàn)較低,當(dāng)機體處于炎癥反應(yīng)時其水平明顯升高,這是由于單核巨噬細(xì)胞分泌的具有防御和治病雙重作用的細(xì)胞因子所導(dǎo)致[14]。NF-kB在調(diào)解細(xì)胞反應(yīng)中有著重要的作用,在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起著關(guān)鍵的作用。NF-kB可以通過調(diào)節(jié)與炎癥細(xì)胞浸入有關(guān)的因子基因表達(dá),在炎癥反應(yīng)與免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]。ICA是淫羊藿的提取物,淫羊藿中被分離鑒定的單體化合物有260余種,但其中以ICA的含量最高。王坤雅通過研究證實,淫羊藿苷可以下調(diào)EMs細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9蛋白,從而抑制EMs細(xì)胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)ICA通過抑制NF-kB p65蛋白的磷酸化和阻斷IkB-a蛋白降解,提高GR-mRNA和蛋白的表達(dá)水平,調(diào)節(jié)GR受體,抑制NF-kB活化及下游炎性因子產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用。ICA通過抑制由NF-κB和PPARα和PPARγ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對大鼠缺血性中風(fēng)具有神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果顯示,ICA可以顯著降低大鼠EMs組織中的TNF-α、IL-6、IL-8的含量。并且,ICA高劑量組和ICA低劑量組都可以對異位內(nèi)膜起到抑制作用。高劑量組強于低劑量組。說明ICA通過抑制EMs異位組織促炎癥因子的釋放,改善EMs。其改善可能由于ICA通過對NF-kB信號通路的抑制而發(fā)揮的作用。從實驗結(jié)果可知ICA可以顯著降低EMs大鼠異位組織中的NF-kB蛋白的磷酸化水平。從某種程度上也說明ICA可以抑制內(nèi)膜異位組織中的NF-kB蛋白的激活,抑制下游炎癥基因的轉(zhuǎn)錄,抑制促炎因子的釋放,起到緩解EMs的作用。

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