呂泓霖，許成梅，陳 丹，馬雅鴿，陳朝銀，趙聲蘭

（1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2. 云南省煙草監(jiān)測站，昆明 650106；3. 云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明 650106）

學(xué)習(xí)和記憶是腦的重要機(jī)能之一，改善和延緩學(xué)習(xí)記憶能力減退是人類追求強(qiáng)大和健康的方向和手段之一[1]。記憶力減退的產(chǎn)生是外界因素影響與人體功能紊亂交互作用所致，現(xiàn)代社會飲食結(jié)構(gòu)變化，精神壓力增大，使腦代謝紊亂，導(dǎo)致記憶力下降。同時隨著人口老齡化，老年人口比例增加，我國60歲以上的人口中，有70%～80%伴有不同程度的健忘和老年癡呆。目前臨床上藥物對老年癡呆導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙的治療效果不理想[2]，因此，早期預(yù)防和干預(yù)老年癡呆是目前研究的重點(diǎn)之一[3-4]。

核桃又名胡桃、羌桃，系胡桃科 （Juglandaceae）的核桃屬（JuglanLinn.）、山核桃屬（Carya）、緣核桃屬（Annamocarya） 等果木兼用植物[5]。我國核桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，有豐富的核桃資源[6]。核桃仁含油脂58.8%，富含w–6和w–3脂肪酸以及神經(jīng)酸、鱈油酸、角鯊烯、植物固醇、多酚等功能性成分[7]。其中核桃多酚往往隨加工副產(chǎn)物被廢棄，造成資源浪費(fèi)，核桃多酚類化合物主要是酚酸和單寧類，以及少量的黃酮類化合物。核桃被歷代醫(yī)家稱為藥食同源的健腦益智佳品[8]，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)研究核桃改善學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制[9]，為云南豐富核桃資源的利用提供新思路，也為核桃改善記憶的產(chǎn)品開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)打破了藥物–單一靶標(biāo)的研究方式，通過進(jìn)行多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到藥物–靶點(diǎn)–疾病復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從整體探索中藥多成分與靶點(diǎn)的作用關(guān)系。其中中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）包含中國藥典中的499種中藥，共29 384種成分，3 311種靶點(diǎn)，837種相關(guān)疾病。Geencard是人類基因綜合數(shù)據(jù)庫，包含基因組、蛋白組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上的基因。OMIM提供已知遺傳疾病的相關(guān)基因信息。STRING是搜索已知蛋白相互關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，是覆蓋物種最多，相互作用信息最全的。DAVID是一個生物信息數(shù)據(jù)庫，其整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大規(guī)模的基因或蛋白列表（成百上千個基因ID或者蛋白ID列表）提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。CB-Dock分子對接在線平臺的特點(diǎn)是可以預(yù)測給定蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)[10-11]。

1 數(shù)據(jù)來源及分析方法

1.1 核桃活性成分及作用靶點(diǎn)的收集

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP），輸入關(guān)鍵詞“Walnut”檢索，口服生物利用度是藥物篩選的關(guān)鍵參數(shù)[12]，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥15%進(jìn)行篩選[13]，得到核桃的主要化學(xué)成分，并匹配相應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.2 記憶靶點(diǎn)的收集

采用綜合性人類基因數(shù)據(jù)庫（Geencard）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）輸入“memory”為關(guān)鍵詞，以評分≥5篩選記憶相關(guān)的靶點(diǎn)[14]，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)，得到改善記憶的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 核桃化合物–靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核桃活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)和記憶相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行比較，獲得二者共有的靶點(diǎn)[15]，然后使用Cytoscape3.7.1圖形化網(wǎng)絡(luò)分析和編輯的軟件，進(jìn)行“核桃活性化合物–記憶靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)表示核桃活性成分、記憶相關(guān)靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)中的邊用來連接藥物與活性成分、活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)，疾病與關(guān)鍵靶點(diǎn)。在網(wǎng)絡(luò)中一個節(jié)點(diǎn)的度表示和節(jié)點(diǎn)相連的條數(shù)，度值越大說明這個節(jié)點(diǎn)越可能是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[16]。

1.4 GO功能富集和KEGG信號通路分析

利用 DAVID數(shù)據(jù)庫對核桃改善記憶的靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析[17]，以統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量評估相關(guān)性，設(shè)置P<0.05，并將富集結(jié)果進(jìn)行圖表可視化[18]。

1.5 蛋白互做網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING是搜索已知蛋白和未知蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，為了闡述核桃改善記憶蛋白的相互作用關(guān)系，將 1.3得到核桃改善記憶靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇“人”，該數(shù)據(jù)庫可以對蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系進(jìn)行打分，分值越高表明相互作用的置信度高[19]，本文將相互作用評分設(shè)置為中置信度（0.400），得到核桃改善記憶蛋白的相互作用關(guān)系（PPI）。

1.6 分子對接驗(yàn)證

為了確定網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測核桃改善記憶靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，采用分子對接進(jìn)行驗(yàn)證。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中評分較高的蛋白與KEGG結(jié)果中靠前的通路進(jìn)行比較分析，得到準(zhǔn)備驗(yàn)證的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)輸入 PDB數(shù)據(jù)庫，選擇最佳的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并從 PubChem數(shù)據(jù)庫中下載核桃化學(xué)成分3D結(jié)構(gòu)式。將關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)、核桃主要成分結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入到CB-Dock在線平臺進(jìn)行分子對接，預(yù)測潛在蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)空腔大小排序選擇幾個得分最大的空腔，設(shè)置空腔的中心，調(diào)整空腔尺寸，之后用 AutoDock Vina程序進(jìn)行分子對接[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）得到核桃化學(xué)成分共 20種（見表 1），其中口服生物利用率、血腦屏障透過率、成藥性較好的有methyl- octadecanoate（十八碳酸甲酯）類等成分。生物利用度較低的如 Cornustannin 2（山茱萸鞣質(zhì)），一般不宜口服給藥，可注射給藥；血腦屏障透過率較低的如pentagalloylglucose（五沒食子酰葡糖）等可通過修飾和劑型選擇加以提高；成藥性較低的如 Casuarictin（木麻黃素）則可通過包埋、乳化等適當(dāng)方法加以調(diào)整。

表1 核桃活性成分信息

2.2 記憶相關(guān)的靶點(diǎn)

采用人類基因疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)庫（Geencard）和孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM），收集與記憶有關(guān)的靶點(diǎn)[22]，選擇得分≥5的靶點(diǎn)[23]，得到 5 559個記憶相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.3 藥物–疾病靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

將核桃活性成分的作用靶點(diǎn)與記憶相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到38個共有靶點(diǎn)，對應(yīng)的核桃活性成分8個（見表2）。

構(gòu)建“中藥化合物–作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)[24]，如圖1，網(wǎng)絡(luò)中共有48個節(jié)點(diǎn)，91條相互作用的邊。通過 Cytoscape計(jì)算網(wǎng)絡(luò)參數(shù)，得到核桃活性成分和靶點(diǎn)作用關(guān)系[25]，核桃中化學(xué)成分按節(jié)點(diǎn)度值排序由高到低依次是 ellagic acid（鞣花酸）、euprostin A、Pentagalloylglucose（沒食子酰葡萄糖）、juglone（胡桃醌）、Juglanin（胡桃苷）、Methyl 9-cyclopropylnonanoate（9–環(huán)丙基壬酸甲酯）。這些化學(xué)成分是核桃改善記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時節(jié)點(diǎn)度值較高的靶點(diǎn)是 PTGS2（前列腺素環(huán)氧合酶）、PRKCB（蛋白激酶Cβ型）、PRKCA（蛋白激酶 Cα型）等，提示核桃改善記憶是多成分、多靶點(diǎn)共同作用。

表2 核桃活性成分的改善記憶的靶點(diǎn)

圖1 核桃活性成分–記憶靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 核桃改善記憶靶點(diǎn)的GO功能分析

通過對核桃改善記憶的38個靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，其中生物學(xué)功能富集排名靠前的有蛋白激酶C活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白的活性，以及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、煙酰胺–腺嘌呤二核苷酸磷酸結(jié)合、血紅素結(jié)合、類固醇激素受體活性（見表3），這些GO功能可能是核桃改善記憶的重要生物學(xué)過程。

2.5 核桃改善記憶靶點(diǎn)的通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對核桃改善記憶的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG通路富集分析（P<0.05），篩選前20條記憶相關(guān)通路（見表4），主要涉及到IL–17信號通路、松弛素信號通路、血管平滑肌收縮、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、NF–κB信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1信號通路、5–羥色胺能突觸、鞘脂信號通路、內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣的重吸收、谷胱甘肽代謝、TNF信號通路等，提示核桃改善記憶的靶點(diǎn)分布在多條通路中，核桃改善記憶是多條通路相互作用的結(jié)果。

圖2 核桃改善記憶靶蛋白互做（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

表3 核桃改善記憶靶點(diǎn)的GO功能富集

2.6 靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核桃改善記憶的靶點(diǎn)輸入到 String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），共有 38個節(jié)點(diǎn)和164條相互作用連線，節(jié)點(diǎn)平均自由度為8.6。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度排序，關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白依次為VEGFA（激素區(qū)的血管內(nèi)皮生長因子A）、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）、CAT（抗氧化區(qū)的觸酶）、MMP9 (基質(zhì)金屬蛋白酶9）、RELA（轉(zhuǎn)錄因子p65）、PRKCB（蛋白激酶C beta II）、PRKCA（蛋白激酶Cα 型）。

2.7 分子對接驗(yàn)證

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）中評分較高的蛋白可以認(rèn)為起到重要作用，將評分較高的潛在蛋白相對應(yīng)的靶點(diǎn)與KEGG通路分析結(jié)果進(jìn)行比較分析，將核桃改善記憶的潛在靶點(diǎn) PRKCA（蛋白激酶Cα型）、PRKCB（蛋白激酶 Cβ型）作為分子對接的對象。導(dǎo)入 PDB數(shù)據(jù)庫，得到 PRKCA、PRKCB分辨率較高的蛋白結(jié)構(gòu)3iw4、2i0e。在“活性成分–記憶靶點(diǎn)”中選擇度值較高的核桃活性成分：鞣花酸、沒食子酰葡萄糖、胡桃醌作為對接分子，在CB-Dock在線平臺進(jìn)行對接，以Vina score得分來評價對接結(jié)果（見表5）。Vina是以相應(yīng)的口袋參數(shù)對受體和配體進(jìn)行分子對接所得到復(fù)合物的得分，這個值越低代表受體和配體親和力越高，對接結(jié)果越好。結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選得到的活性成分與預(yù)測的靶點(diǎn)均有結(jié)合，其中鞣花酸（ellagic acid）、沒食子酰葡萄糖（Pentagalloylglucose）均與PRKCA、PRKCB靶點(diǎn)有較強(qiáng)的親和力（見圖3）。

表4 核桃改善記憶靶點(diǎn)的KEGG通路

表5 核桃活性成分與靶點(diǎn)蛋白分子對接評分

圖3 主要活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對接

3 討論

我國核桃種植面積和產(chǎn)量居全國第一，品種多樣，資源豐富，一直以來是藥食同源的健腦佳品。核桃可提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可減緩D–gal模型小鼠的記憶障礙[26]。核桃改善學(xué)習(xí)記憶具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行分析，找到核桃改善記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要靶點(diǎn)。篩選得到8個核桃的活性成分，如鞣花酸、胡桃醌、沒食子單寧等，對應(yīng)38個核桃改善記憶的靶點(diǎn)，核桃活性成分通過協(xié)同作用與記憶相關(guān)的靶點(diǎn)，有前列腺素環(huán)氧合酶、蛋白激酶Cα型、蛋白激酶 Cδ和蛋白激酶 Cγ型等，其中前列腺素環(huán)氧合酶–2可以將花生四烯酸酯轉(zhuǎn)化為前列腺素H2（PGH2），前列腺素可調(diào)節(jié)大鼠海馬組織 VEGF、BDNF蛋白的表達(dá)，并可改善癡呆大鼠的記憶功能[27]，蛋白激酶C是絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶家族一員，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中心分子之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等多種生物代謝的功能。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用[28]，PRK是突觸功能調(diào)節(jié)器，包括調(diào)節(jié)突觸合成、囊泡充填及多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。同時活化的PKC能增加海馬乙酰膽堿的釋放[29]。此外，PKC的活化還能增強(qiáng)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性，導(dǎo)致乙酰膽堿形成增多進(jìn)而參與學(xué)習(xí)記憶的形成過程。這些核桃改善記憶的靶點(diǎn)涉及的生物學(xué)過程主要包括抗氧化過程的調(diào)節(jié)、蛋白激酶C的活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核轉(zhuǎn)錄因子的活性等，這些生物學(xué)過程通過協(xié)同作用來改善記憶。

通過對改善記憶的靶點(diǎn)進(jìn)行 KEGG通路富集，主要作用20條通路，如血管平滑肌收縮信號通路（調(diào)節(jié)靶點(diǎn)蛋白PRKCB、PRKCA等蛋白激酶家族的蛋白進(jìn)行傳導(dǎo)）、NF–κB 信號通路、5–羥色胺能突觸、谷胱甘肽代謝等，其中MAPK信號通路（PRKCB、PRKCA等涉及到6個靶蛋白），MAPK是聯(lián)系細(xì)胞膜受體與細(xì)胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)靶目標(biāo)的進(jìn)化保守的酶類，可以調(diào)節(jié)AD中的標(biāo)志物Tua蛋白，防止其過度磷酸化[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)Tua蛋白發(fā)生過度磷酸化是由于體內(nèi)蛋白激酶引起，而促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在 Tua蛋白磷酸化中占有重要的位置[31-32]。Goldin發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK對海馬神經(jīng)元樹突棘結(jié)構(gòu)的形成與變化具有調(diào)控作用，此過程可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息的長期存儲功能有關(guān)[33]。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究核桃改善記憶多靶點(diǎn)、多成分和多通路間復(fù)雜的相互關(guān)系，同時采用分子對接對核桃活性成分和改善記憶的潛在靶點(diǎn)的結(jié)合能力進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)鞣花酸、沒食子酰葡萄糖均與PRKCA、PRKCB有較強(qiáng)的親和力。核桃作為保健食品，目前的研究主要集中在核桃產(chǎn)品開發(fā)的工藝上，對核桃改善記憶的功能研究還較少，本文為核桃改善記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)分析和作用機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)，為核桃全產(chǎn)業(yè)鏈開發(fā)提供新思路。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。