同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092

RNA修飾的種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)在真核生物的RNA上有100多種修飾，其中RNA甲基化修飾是RNA修飾的主要形式之一，約占RNA修飾的60%以上[1]。常見的RNA甲基化修飾類型包括6-甲基腺嘌呤（6-methyladenosine，m6A）、1-甲基腺嘌呤（1-methyladenosine，m1A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）、5-羥 甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，hm5C）、3-甲基胞嘧啶（3-methylcytosine，m3C）和假尿嘧啶（Ψ）等，其中m6A修飾是真核生物mRNA上含量最為豐富的RNA修飾[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，mRNA上m6A修飾位點(diǎn)的基序（motif）具有高度保守性，主要發(fā)生在RRACH（R：嘌呤；A：腺嘌呤；H：非鳥嘌呤）序列的腺嘌呤上[3-4]。m6A修飾在mRNA前體（pre-mRNA）上主要富集在剪接位點(diǎn)附近以及最后一個外顯子上，而在成熟mRNA上則主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)（transcription start site，TSS）、序列編碼區(qū)（coding sequence，CDS）和3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR），尤其會富集在終止密碼子附近和3'UTR的前1/4處[5-6]。此外，m6A修飾在初級miRNA（pri-miRNA）上也有富集。

1 m6A修飾相關(guān)蛋白

在m6A修飾過程中，有3類分子參與了調(diào)控，包括甲基化轉(zhuǎn)移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）和甲基化結(jié)合蛋白（reader）[7]。

催化m6A生成的甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物核心組分包括METTL3、METTL14和WTAP[8]。METTL3和METTL14可以1∶1的比例形成具有催化活性的二聚體，對靶mRNA相應(yīng)位點(diǎn)的腺嘌呤催化6-甲基化修飾[9]。WTAP本身不具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，但可以調(diào)控METTL3/METTL14復(fù)合物與mRNA的結(jié)合以及細(xì)胞內(nèi)的亞定位，敲降WTAP會導(dǎo)致METTL3/METTL14復(fù)合物與RNA的親和力降低，并會引起METTL3/METTL4復(fù)合物在mRNA剪接與核糖核蛋白裝配的亞細(xì)胞器-核小斑上的定位減弱[10]。除了核心組分外，目前還發(fā)現(xiàn)其他多種組分，包括KIAA1429[11]、RBM15[12]、ZC3H13[13-14]和METTL16[15-16]等，也可以作為調(diào)節(jié)亞基參與RNA甲基化的形成。

m6A修飾是可逆的。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2種m6A去甲基化酶，即FTO[17]和ALKBH5[18]，均屬于二價鐵/α-酮戊二酸鹽依賴型雙加氧酶ALKB家族。FTO是第一個被鑒定的m6A去甲基化酶。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO對于單鏈RNA上的m6A修飾具有去甲基化活性，并且在細(xì)胞內(nèi)敲降FTO會導(dǎo)致mRNA的m6A修飾水平升高，而過表達(dá)FTO則會導(dǎo)致mRNA的m6A修飾水平降低。FTO可以通過2步催化反應(yīng)氧化去甲基，定位于細(xì)胞核中的FTO可以催化m6A的去甲基化，而細(xì)胞質(zhì)中的FTO具有催化m6Am和m6A去甲基化的活性。ALKBH5可以直接催化m6A去甲基化，在與FTO的氧化去甲基過程中會產(chǎn)生hm6A和fm6A這2種中間產(chǎn)物[19]。ALKBH5的去甲基化過程不會產(chǎn)生中間產(chǎn)物。在敲降A(chǔ)LKBH5的細(xì)胞中，mRNA的m6A修飾水平顯著提高；ALKBH5敲除小鼠的睪丸組織中，m6A修飾水平同樣顯著提高[18]。

m6A結(jié)合蛋白可以讀取RNA甲基化修飾信息，并且參與調(diào)控mRNA加工和代謝。目前已知哺乳動物的m6A結(jié)合蛋白主要有YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白質(zhì)[20]和真核起始因子3（ef3），包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1[21]、YTHDC2、HNRNPA2B1、HNRNPC[22]和HNRNPG[23]等。YTHDF1和YTHDF3可協(xié)同調(diào)控mRNA翻譯[24-25]。YTHDF2可以介導(dǎo)m6A修飾的mRNA降解[26-27]。YTHDC2也定位于細(xì)胞質(zhì)中，參與調(diào)控靶mRNA的翻譯[28-29]。YTHDC1定位在細(xì)胞核中，可調(diào)節(jié)mRNA的剪接和出核[30-31]。HNRNPA2B1參與mRNA的選擇性剪接和前體miRNA（pre-miRNA）的加工[32-33]。ef3可以與5'UTR區(qū)域的m6A結(jié)合，介導(dǎo)mRNA翻譯的起始[34]。

2 m6A修飾的生物學(xué)功能

2.1 m6A修飾調(diào)控mRNA剪接

mRNA前體的剪切和拼接是形成成熟mRNA的重要環(huán)節(jié)，m6A修飾在mRNA前體中多位于內(nèi)含子區(qū)域[35]，而敲除FTO會增強(qiáng)剪接因子SRSF2與m6A修飾的mRNA前體的結(jié)合，從而使外顯子更易于包含在剪接后的成熟mRNA中[36]。m6A結(jié)合蛋白YTHDC1可與剪接因子SRSF3（SRp20）和SRSF10（SRp38）結(jié)合，并促進(jìn)SRSF3與mRNA前體的結(jié)合，繼而參與選擇性剪接的調(diào)控，并通過選擇性剪接最后一個外顯子，調(diào)控mRNA的多聚腺苷酸化。此外，YTHDC1與SRSF10的結(jié)合可阻礙剪接因子SRSF10與RNA前體的結(jié)合，從而抑制SRSF10介導(dǎo)的外顯子跳讀[30]。

2.2 m6A修飾調(diào)控mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)

m6A修飾可以促進(jìn)成熟mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，敲降METTL3會抑制mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[37]，而敲除ALKBH5會促進(jìn)mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。m6A結(jié)合蛋白YTHDC1可以通過與SRSF3結(jié)合而招募出核受體蛋白NXF1，進(jìn)而調(diào)控mRNA的出核轉(zhuǎn)運(yùn)[31]。

2.3 m6A修飾影響mRNA翻譯

m6A修飾能夠在多個層面調(diào)控mRNA的翻譯。METTL3可以通過結(jié)合mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)，并招募eIF3參與mRNA的翻譯[38]。WANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，m6A結(jié)合蛋白YTHDF1可以促進(jìn)核糖體與靶mRNA的結(jié)合，敲降YTHDF1雖然不影響靶mRNA的穩(wěn)定性，但是明顯降低靶mRNA的翻譯效率。機(jī)制研究顯示，YTHDF1的N端可以通過直接結(jié)合eIF3而招募翻譯起始復(fù)合物，從而促進(jìn)m6A修飾的mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)依賴型的翻譯[24]。MEYER等[34]報(bào)道，在5'帽子結(jié)構(gòu)非依賴型的翻譯調(diào)控中，eIF3可以通過直接結(jié)合位于5'UTR區(qū)域的m6A位點(diǎn)而促進(jìn)mRNA的翻譯。

2.4 m6A修飾調(diào)控mRNA降解

有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中敲降METTL3或METTL14會增加靶mRNA的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，m6A修飾水平與mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[8,39]。WANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在Hela細(xì)胞中敲降YTHDF2會導(dǎo)致YTHDF2的靶mRNA的水平和壽命都顯著增加；機(jī)制研究顯示，YTHDF1的C端可以識別并結(jié)合mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)并形成YTHDF1-mRNA復(fù)合物，并運(yùn)輸RNA至細(xì)胞質(zhì)處理小體（P-小體）等細(xì)胞RNA降解位點(diǎn)（cellular RNA decay site）而降解RNA[26]。

2.5 m6A修飾影響mRNA結(jié)構(gòu)

m6A修飾還可參與RNA特定結(jié)構(gòu)的形成。研究顯示，m6A修飾減弱了腺嘌呤與尿嘧啶之間的氫鍵作用，從而改變了RNA特定區(qū)域的結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)RNA結(jié)合蛋白HNRNPC與RNA的結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控這些RNA的剪切，顯示m6A修飾可以充當(dāng)開關(guān)以調(diào)控RNA與RNP的相互作用[22]。

2.6 m6A修飾對于非編碼RNA的調(diào)控

初級miRNA在Drosha/DGCR8復(fù)合物的作用下加工產(chǎn)生前體miRNA是miRNA生物合成中的關(guān)鍵步驟，m6A修飾在此過程中發(fā)揮了重要作用。METTL3可催化初級miRNA發(fā)生m6A修飾，HNRNPA2B1可識別該修飾并招募DGCR8，使Drosha/DGCR8復(fù)合物定位于前體miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域而參與miRNA的加工[32-33]。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200 nt且不具備蛋白質(zhì)編碼潛能的RNA分子，可以通過不同的機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)而參與多種生物學(xué)過程。lncRNA轉(zhuǎn)錄本中存在大量m6A修飾位點(diǎn)，與m6A修飾對于mRNA的調(diào)控相類似，m6A修飾也可調(diào)控lncRNA表達(dá)、剪切和特定二級結(jié)構(gòu)的形成。值得注意的是，m6A修飾可以影響lncRNA與特定miRNA的結(jié)合。YANG等[40]發(fā)現(xiàn)，linc1281可以充當(dāng)一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），通過競爭性結(jié)合let-7家族miRNA而調(diào)控胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的分化；linc1281與let-7 miRNA的結(jié)合是m6A修飾依賴的，雖然m6A修飾位點(diǎn)與let-7 miRNA結(jié)合位點(diǎn)并不重合，但缺失m6A修飾會導(dǎo)致linc1281不能與let-7 miRNA結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致ESC分化異常。

3 m6A修飾調(diào)控干細(xì)胞的自我更新

在人和小鼠ESC中，利用meRIP-Seq等方法，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人和小鼠ESC中有7 000多個mRNA上有m6A修飾。WANG等[39]率先報(bào)道在小鼠ESC中敲降METTL3或METTL14會導(dǎo)致ESC喪失多能性；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲降METTL3或METTL14后，一系列發(fā)育調(diào)節(jié)基因（包括FGF5、OTX2和PITX2等）由于喪失m6A修飾，其穩(wěn)定性提高，表達(dá)量增加。此后，BATISTA等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在人和小鼠的ESC中，許多參與干細(xì)胞多能性維持的基因（包括SOX2和Nanog）的mRNA上都有m6A修飾，且這些修飾位點(diǎn)在人和小鼠中是保守的，敲降METTL3會增強(qiáng)ESC的自我更新能力，并抑制其分化。GEULA等[42]的進(jìn)一步研究揭示了METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在ESC多能性維持中的作用取決于ESC所處的狀態(tài)，在原始多能性狀態(tài)下，敲降METTL3會導(dǎo)致保持原始態(tài)多能性的基因由于m6A修飾的喪失而使其穩(wěn)定性上升，從而導(dǎo)致ESC進(jìn)入超原始態(tài)多能性（“hyper”-na?ve pluripotency）而喪失分化能力；在活化多能性狀態(tài)下，敲降METTL3則會導(dǎo)致譜系分化基因由于m6A修飾的喪失而使其穩(wěn)定性上升，導(dǎo)致ESC的分化加快。上游信號和染色質(zhì)結(jié)合蛋白也可以通過影響m6A甲基化修飾而影響ESC的自我更新。AGUILO等[43]發(fā)現(xiàn)，在多能性狀態(tài)的ESC中，鋅指蛋白ZFP217通過與METTL3結(jié)合，減少了METTL3在諸如SOX2、Nanog和KLF4等多能性基因上的結(jié)合，從而減少這些基因mRNA上的m6A修飾水平，進(jìn)而增加這些mRNA的穩(wěn)定性；分化起始后，ZFP217表達(dá)下調(diào)，METTL3/METTL14得以催化多能性mRNA上的m6A修飾，使得這些多能性mRNA因甲基化而被降解，確保分化的進(jìn)行。BERTERO等[44]開展的ESC研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β通路成員SMAD2/3可與METTL3/METTL14/WTAP復(fù)合物相互作用而介導(dǎo)METTL3復(fù)合物在SMAD2/3靶基因NanogmRNA上的結(jié)合并催化m6A修飾，進(jìn)而使mRNA的穩(wěn)定性下降，從而在分化起始時使細(xì)胞迅速退出多能性狀態(tài)并開始分化。在小鼠ESC中，敲ZC3H13會使細(xì)胞喪失多能性，導(dǎo)致整體m6A修飾水平下降；Zc3h13通過與WTAP、Virilizer和Hakai形成復(fù)合物，使后者定位于細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)控m6A的修飾水平[14]。

4 m6A修飾在神經(jīng)分化中的作用

m6A修飾在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。利用Nestin-Cre小鼠，YOON等[45]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)中條件敲除METTL14后，腦內(nèi)m6A修飾丟失，會導(dǎo)致放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期變長，進(jìn)而在小鼠出生后也能觀察到神經(jīng)發(fā)生的現(xiàn)象；敲降METTL3后，也能觀察到類似現(xiàn)象。大腦皮質(zhì)的m6A測序分析顯示，轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞周期和神經(jīng)元分化相關(guān)基因的mRNA在METTL14條件敲除鼠的大腦皮質(zhì)中出現(xiàn)富集，顯示由于m6A修飾的缺失延緩了mRNA的降解，從而影響了神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期和神經(jīng)元的發(fā)生。WANG等[46]也觀察到條件敲除METTL14后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變慢以及出現(xiàn)過早分化，提示m6A修飾可以增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新。研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，m6A修飾的缺失會上調(diào)特定基因（如KIF26A、GAS7和PDGFRB等）區(qū)域的H3K27Ac修飾水平以及EGR2和EGR3基因區(qū)域的H3K27me3修飾水平，并且通過增強(qiáng)CBP/p300 mRNA的穩(wěn)定性而影響H3K27Ac修飾。敲除METTL3還會影響小鼠小腦內(nèi)顆粒神經(jīng)元分化和成熟過程中的基因表達(dá)，引發(fā)顆粒神經(jīng)元凋亡和小腦萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重的運(yùn)動障礙和出生后致死[47]。

m6A去甲基化酶也參與調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。FTO在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)（包括成體神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元）中表達(dá)，其表達(dá)量在出生后持續(xù)上調(diào)。敲除FTO不僅會引起腦的體積和質(zhì)量下降，還會引發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力和神經(jīng)元發(fā)生能力的下降，進(jìn)而導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力的下降。基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，并且這些基因的mRNA上均有m6A修飾位點(diǎn)，提示FTO可以通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子通路相關(guān)基因的m6A修飾以調(diào)控小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化，進(jìn)而調(diào)控小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[48]。CAO等[49]在Nestin-Cre-ERT2小鼠成體期（8周齡）條件敲除神經(jīng)系統(tǒng)FTO，發(fā)現(xiàn)雖然短期敲除FTO會增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的分化能力，但是其長期效應(yīng)是抑制神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)育；機(jī)制研究顯示，敲除FTO會特異性增加Pdgfra和Socs5 mRNA上的m6A修飾，而表達(dá)上調(diào)的Pdgfra和表達(dá)下調(diào)的Socs5會協(xié)同促進(jìn)Stat3磷酸化，從而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元的分化。

EDENS等[50]發(fā)現(xiàn)，敲除FMRP編碼基因FMR1后產(chǎn)生的表型與敲除METTL14相類似，并且發(fā)現(xiàn)METTL14敲除和FMR1敲除后，有大量調(diào)控神經(jīng)發(fā)育基因的mRNA滯留在細(xì)胞核中；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRP可以通過結(jié)合m6A修飾的mRNA而介導(dǎo)這些RNA的出核運(yùn)輸[50]。敲除YTHDF2的小鼠會出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育異常和胚胎期致死，其神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力顯著降低，且分化的神經(jīng)元不能形成正常的神經(jīng)突起。YTHDF2敲除小鼠的m6A甲基化分析結(jié)果顯示，神經(jīng)元分化相關(guān)基因如JAK-STAT通路的抑制性基因的m6A信號未被識別，從而導(dǎo)致這些基因降解的延遲[51]。

5 小結(jié)與展望

m6A修飾是目前研究人員較為關(guān)注的一種RNA修飾，其在多種組織和器官的發(fā)育、配子的發(fā)生、干細(xì)胞的自我更新和分化以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等多個生理和病理過程中都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶對于底物RNA選擇的特異性尚不明確。LI等[52]的研究工作提示，一些RNA結(jié)合蛋白可能參與了m6A的甲基化選擇。他們利用m6A-seq技術(shù)對水稻愈傷與葉片組織全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾進(jìn)行深度測序和分析，發(fā)現(xiàn)m6A的甲基化存在組織和細(xì)胞的特異性和選擇性，并命名為選擇性甲基化基因（selectively methylated gene，SMG）；此外，還發(fā)現(xiàn)一些RNA結(jié)合蛋白如pumilio家族蛋白，可與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶競爭結(jié)合mRNA而產(chǎn)生組織或細(xì)胞系的SMG[52]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物除了核心催化組分METTL3和METTL14外，對于其他組分尚未完全闡明，這些組分具有物種特異性（如人的WTAP和擬南芥的FIP37i等），尚不明確其在m6A修飾形成中的作用以及是否參與底物RNA的選擇。

經(jīng)典的m6A去甲基化酶FTO也具有催化mRNA上5'帽子結(jié)構(gòu)的m6A m的去甲基化酶活性，并且調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率[53]。對于tRNA的m1A修飾也具有去甲基化酶的作用[54]。FTO對于底物的偏好性受到其在細(xì)胞內(nèi)亞定位的影響，細(xì)胞核FTO介導(dǎo)m6A去甲基化，細(xì)胞質(zhì)FTO介導(dǎo)m6A m和m6A去甲基化，而究竟哪些因素會影響FTO的細(xì)胞內(nèi)亞定位，目前尚不明確[54]。上述結(jié)果提示，即使是經(jīng)典的m6A相關(guān)催化酶，對其作用底物以及催化活性仍有待進(jìn)一步探究。

m6A的修飾水平受到細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的調(diào)控，而m6A修飾往往具有雙向調(diào)控作用，其生物學(xué)活性有賴于m6A結(jié)合蛋白，例如m6A修飾既能促進(jìn)mRNA的翻譯，又能降低mRNA的穩(wěn)定性，從而加速其降解。這些調(diào)控過程是通過結(jié)合不同的m6A結(jié)合蛋白實(shí)現(xiàn)的，綜合考察不同的結(jié)合蛋白對于m6A修飾的親和力以及結(jié)合蛋白在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)量，有助于更全面地理解m6A修飾的生物學(xué)功能。

綜上所述，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，包括以單分子實(shí)時（single-molecule realtime，SMRT）測序[55]以及單分子納米孔測序[56]為代表的新技術(shù)的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了RNA單分子單堿基精度的修飾水平檢測。此外，新的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶，尤其是其他可能存在的m6A結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)，有助于更好地理解m6A RNA修飾對于基因表達(dá)調(diào)控的作用，以及其在多種生理和病理過程中的作用，同時有力地推動了基于m6A相關(guān)蛋白的藥物研發(fā)。