寧明哲,陶月,陳雨欣,柏 兵（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京210008）

2019年底發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)迅速席卷全球，已成為全球的公共衛(wèi)生大事件，對全球各地區(qū)人民的生命健康和經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失。新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的疾病稱為新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)，據(jù)世界衛(wèi)生組織的實(shí)時數(shù)據(jù)統(tǒng)計，截止2020年7月4日，全球COVID-19 確診病例達(dá)1 130 多萬例，死亡人數(shù)超過52 萬。目前，我國的防控防疫工作已取得階段性成果，COVID-19 抗體檢測是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的主要方法。同時，國家衛(wèi)生健康委員會2020年3月3日發(fā)布的“新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）”，已明確將 COVID-19 IgM 和IgG 抗體作為臨床確診標(biāo)準(zhǔn)[1]。然而，在4月份國家藥品監(jiān)督管理局也提出抗體檢測試劑僅用作對SARSCoV-2 核酸檢測陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測[2-5]，或在疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，不作為SARS-CoV-2 感染者確診和排除的依據(jù)，也不適用于一般人群的篩查。這提示現(xiàn)有SARS-CoV-2 抗體檢測試劑使用過程中可能存在一定的假陰性和假陽性情況。

目前被國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的COVID-19抗體檢測試劑盒廠家有廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司 、唐山英諾特生物技術(shù)有限公司、博奧賽斯（重慶）生物科技有限公司、廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司 、珠海麗珠試劑股份有限公司、珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司、上海芯超生物科技有限公司、南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司、博奧賽斯（重慶）生物科技有限公司、廣東和信健康科技有限公司與丹娜（天津）生物科技有限公司。上述檢測試劑盒主要檢測SARS-CoV-2 特異性的IgM 和IgG 抗體，檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法，包被的抗原包括SARS-CoV-2的N蛋白（Nucleoprotein）、M蛋白（Membrane protein）和S 蛋白（Spike glycoprotein）。需要提出的是，本次流行的SARS-CoV-2 與曾經(jīng)流行的Bat-SL-CoV，SARS-CoV 與MERS-CoV相比，N，M和S 蛋白在氨基酸序列上具有極高的相似性（90%左右）[6]。這是檢測方法中的抗原設(shè)計及結(jié)果判斷應(yīng)當(dāng)考慮的因素。除此之外，COVID-19 的基因末端多出一個新的ORF10 基因，表達(dá)38 個氨基酸。用它作為抗原表位，可極大保證COVID-19 抗體檢測的特異性，但目前的相關(guān)研究和應(yīng)用很少。

由于包被抗原選擇的復(fù)雜性、高質(zhì)量抗體制備的困難性以及免疫學(xué)檢測方法本身的局限性，敏感度高、特異度強(qiáng)的試劑盒需要通過嚴(yán)格的性能驗證。由于疫情的迫切性，上述在極短時間內(nèi)生產(chǎn)出的COVID-19 抗體檢測試劑盒，雖然總體性能尚可，但也出現(xiàn)了一些檢驗結(jié)果與臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征不相符的現(xiàn)象?，F(xiàn)對它們進(jìn)行初步探討，并提供一些應(yīng)對思路。

1 COVID-19 抗體檢測中的假陽性問題

1.1 既往冠狀病毒感染 COVID-19 屬于β 家族的冠狀病毒[7]。根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫，β 家族冠狀病毒該家族中有六種、173 個病毒。COVID-19 中的N 蛋白、P 蛋白、S 蛋白在氨基酸序列上除與非典型性肺炎病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)和中東呼吸綜合征病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus， MERS-CoV) 有高達(dá)90%以上的相似度外，還有多種其它冠狀病毒在基因序列比對中顯示有類似氨基酸序列。這些病毒多數(shù)不致病，但因為有類似序列，可以在人體內(nèi)產(chǎn)生干擾性抗體，從而導(dǎo)致COVID-19 抗體檢測的假陽性問題。該種情況一般導(dǎo)致IgG 抗體假陽性，但不排除IgM 假陽性。

1.2 交叉抗體的存在 人體正常情況下含有1011（1 000 億）個B 細(xì)胞，至少可結(jié)合1 000 萬種不同抗原表位以上的抗體[8]。而正常機(jī)體每天產(chǎn)生109個新的B 細(xì)胞。如此龐大的表位結(jié)合多樣性，完全有可能隨機(jī)產(chǎn)生能與包被在檢測載體中的抗原片段結(jié)合的抗體。另外，人體在環(huán)境中可受到近1 400 種病原體感染，或接受各種致敏原的刺激，會產(chǎn)生更多新的抗體，極大增加了不同人體間抗體庫構(gòu)成的復(fù)雜性，使得干擾抗體可以隨機(jī)存在。這種情況下的假陽性，應(yīng)僅IgG 抗體或IgM 抗體陽性[10]。

1.3 高濃度弱親和力的抗體或蛋白干擾 根據(jù)抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)公式（[Ab]+[Ag]=[Ag-Ab]）及解離常數(shù)Kd=[Ab]*[Ag]/[Ag-Ab]。Kd 越大，親和力越小。一般鼠單抗的親和力在1nmol/L 左右（10-9mol/L），兔單抗的親和力在0.01nmol/L 左右（10-10mol/L）。人體正常血清中IgM 總濃度約為1mg/ml，針對某一表位的抗體IgM 濃度估計在總IgM 濃度的萬分之一以下，因此其有效濃度不超過1nmol/L。在抗原為10nmol/L（約1 μg/ml）和Kd 為1nmol/L 的情況下，1nmol/L 的IgM 將與9%的抗原結(jié)合。當(dāng)Kd 降低1 000 倍（1 000nmol/L）時，僅有0.1%的抗原被結(jié)合，導(dǎo)致檢測信號將降低100 倍。然而，當(dāng)這種低親和力的抗體濃度1 000 倍增高時（1 000nmol/L），近50%的抗原被結(jié)合。而這種親和力高濃度的雜質(zhì)分子在血液中經(jīng)常存在。比如，一般細(xì)胞因子的濃度在1ng/ml 左右，而清蛋白在50mg/ml 左右，有著千萬倍數(shù)的差異，可對檢測造成干擾。

1.4 方法學(xué)本身的問題 特別是膠體金免疫層析法。這種方法方便快捷、便于床邊診斷，但檢測過程中沒有充分的清洗過程，難以有效去除非特異性結(jié)合物質(zhì)。這種情況下，可用緩沖液手工充分洗滌。真陽性的結(jié)果，一般不受洗滌明顯影響。

1.5 其它常見因素的干擾 如類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）[9]、補(bǔ)體、嗜異性抗體、溶菌酶等。

2 COVID-19 抗體檢測中的假陰性問題

2.1 檢測試劑中的抗原設(shè)計與制備 這些抗原蛋白的制備一般采用肽段合成或在質(zhì)粒表達(dá)的方法。合成的肽段和在大腸埃希菌中所表達(dá)的肽段沒有人體中正常情況下的翻譯后修飾（post-translational modification）。在真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的翻譯和修飾是否與COVID-19 所感染的肺泡上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的修飾相同尚不清楚。比如SARS-CoV 的S 蛋白有高達(dá)23 個糖基化位點(diǎn)和7 個二硫鍵。這些被修飾的位點(diǎn)對線性和空間抗原表位有著決定性作用，在合成或重組表達(dá)的抗原中未必完全存在，這樣就可能導(dǎo)致檢測的假陽性。

2.2 雙抗原夾心法容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果 這種方法需要兩個抗原與抗體特異性反應(yīng)同時存在。前已述及，由于抗原抗體反應(yīng)的平衡性及Kd 常數(shù)，抗原與抗體并非100%結(jié)合。假如只有70%結(jié)合時，兩者同時結(jié)合，以形成最終的有效被檢測物時，只有近一半（49%）。雙抗原夾心法檢測抗體的另一個缺點(diǎn)是空間位阻問題。包被抗原與標(biāo)記抗原在待測血清標(biāo)本中并非游離存在。因為血清的蛋白濃度極高（50～70 μg/μl），蛋白容易相互附著。一個抗體雙臂上抗原結(jié)合區(qū)域之間的空間較小。當(dāng)包被抗原與標(biāo)記抗原與待測血清中的蛋白有相互附著時，會因為空間位阻的原因而影響其與待測抗體的結(jié)合，而造成檢測的假陰性。

2.3 試紙條的膠體金免疫層析法更易產(chǎn)生假陰性結(jié)果 相對于其它常規(guī)免疫學(xué)檢測方法中30 min 左右的抗原抗體結(jié)合時間，膠體金試紙條法的反應(yīng)時間一般在1 min 內(nèi)完成，抗原抗體可能無法充分混勻及反應(yīng)，造成假陰性的結(jié)果，而且陽性結(jié)果的線性定量關(guān)系較差。另外，在膠體金試紙條檢測COVID-19 抗體的方法中，抗原包被膜條，膠體金標(biāo)記抗人IgM 或IgG。在人血清標(biāo)本中IgM 和IgG的含量極高，而真正待測抗體的濃度應(yīng)該在萬分之一以下，而膠體金標(biāo)記的二抗與血清標(biāo)本中如此高濃度的IgM 或IgG 完全結(jié)合，導(dǎo)致因靈敏度不足而出現(xiàn)的檢測假陰性。

2.4 其它導(dǎo)致檢測假陰性的常見問題 如基質(zhì)干擾、鉤狀反應(yīng)等。

3 COVID-19 抗體檢測問題的解決思路

3.1 同時檢測針對SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗體[10-11]，在接觸感染源后的第一個星期左右，IgM和IgG 可同時出現(xiàn)陽性。同時檢測針對SARSCoV-2 的IgM 和IgG 抗體可提高敏感度。

3.2 動態(tài)檢測SARS-CoV-2 的IgM 和IgG 抗體感染初期，第一次抗體檢測陽性時，在3～7 天后再次檢測，IgM 和IgG 水平一般都出現(xiàn)4 倍升高。

3.3 建議用不同蛋白（如聯(lián)用N 蛋白和S 蛋白）或不同序列的肽段作為包被抗原的試劑盒，進(jìn)行復(fù)查。如為假陽性，兩者同時陽性的可能性較小。

3.4 對金標(biāo)試紙條可能存在的假陽性，可考慮用磷酸鹽（PBS）緩沖液洗滌震蕩3～5 次；對金標(biāo)試紙條的假陰性，可考慮將前端含有膠體金的墊片取下，先將試紙條插入血清中進(jìn)行充分層析。然后將膜條移入新的濾紙，并在洗脫的膠體金中進(jìn)行層析。

3.5 對于非特異性蛋白吸附造成空間位阻的問題，可在樣本中加入較強(qiáng)的去垢劑。一般免疫學(xué)檢測方法中所用的緩沖液僅含0.05%的吐溫-20，不足以去除較強(qiáng)干擾蛋白的吸附。此時可考慮選擇1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），甚至RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）緩沖液。這可適用于膠體金試紙條法，但不適用于抗原或抗體被動吸附于固相載體上的免疫學(xué)方法。

3.6 懷疑為類風(fēng)濕因子（RF）等干擾時，可直接檢測RF水平；當(dāng)RF水平較高時，可考慮為RF水平的干擾。

4 結(jié)論

血清新型冠狀病毒特異性的抗體檢測是對疑似新型冠狀病毒患者的補(bǔ)充檢測。但是如果將抗體檢測應(yīng)用于臨床大規(guī)模檢測時，則需要考慮潛在檢測假陽性和假陰性的問題，本文也提出了一些解決思路。相信隨著對SARS-CoV-2研究的深入，抗體檢測方法和檢測性能會愈發(fā)完善，從而有可能用于大規(guī)模人群的篩查和診斷中，以更好地幫助臨床診斷和流行病的回顧性研究。