宋玉夢(mèng) 周紅艷 黃鑫 梅予鋒

變異鏈球菌是公認(rèn)的致齲菌，可通過(guò)黏附、產(chǎn)酸和耐酸作用破壞牙體組織而形成齲壞。目前國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)應(yīng)用氟化物和氯己定等化學(xué)合成藥物抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)以達(dá)到防治齲病的目的，但因存在穩(wěn)定性、耐藥性、毒副作用等問(wèn)題，致使尋找安全有效的抗菌藥物成為齲病預(yù)防的當(dāng)務(wù)之急，目前已有一些植物提取物作為抗菌藥抑制致齲菌的生長(zhǎng)[1-2]。近年來(lái)，有研究證實(shí)茶樹(shù)精油(tea tree oil,TTO)可以有效抑制牙菌斑的形成，起到齲病預(yù)防的作用[3]。但有效抑菌濃度、殺菌時(shí)間，抑菌效果及穩(wěn)定性等均未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬初步探究TTO對(duì)變異鏈球菌的最小抑菌濃度、最小殺菌濃度，評(píng)價(jià)不同濃度TTO對(duì)變異鏈球菌抑菌率，探索TTO殺菌時(shí)間和殺菌效果維持時(shí)間，為T(mén)TO的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

變異鏈球菌ATCC-25175由南京醫(yī)科大學(xué)口腔研究所提供；茶樹(shù)精油(TTO,純度為98%，南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司)；牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI，Difco，美國(guó))；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma，美國(guó))；洗必泰(福建維真園醫(yī)藥科技有限公司)；厭氧培養(yǎng)箱(Bugbox M，英國(guó))；超凈工作臺(tái)(SG403，貝克公司,美國(guó))；光吸收型酶標(biāo)儀(Spectramax190，MD,美國(guó))。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)菌復(fù)蘇和培養(yǎng) 取-80 ℃凍存的變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)菌株，室溫下解凍后接種于BHI 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫厭氧箱(80%N2，10%CO2，10%H2)內(nèi)復(fù)蘇24 h，挑取單克隆菌株繼續(xù)培養(yǎng)24 h后制備菌懸液，用PBS將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×106CFU/ml，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取凍存菌液20 ml置于錐形瓶?jī)?nèi)，37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h 取1 ml液體，離心后PBS重懸，取200 μl置于96 孔板內(nèi)，用微孔板分光光度計(jì)測(cè)吸光度值(A=600)。繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 TTO對(duì)游離變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

1.2.2.1 TTO對(duì)變異鏈球菌抑菌環(huán)的影響 采用改良的牛津杯法[4]檢測(cè)TTO對(duì)變異鏈球菌抑菌環(huán)大小。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，濃度調(diào)整為1×106cfu/ml[5]，取100 μl涂平板，在同一培養(yǎng)皿內(nèi)放置5 個(gè)自制牛津杯，各孔分別加入100 μl TTO，濃度為20%、10%、5%，另設(shè)2 個(gè)對(duì)照組，分別加入100 μl 0.2%氯己定(CHX)，100 μl滅菌0.5%Tween-80。4 ℃靜置2 h，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2.2 TTO對(duì)變異鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC) 根據(jù)CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)方法[6]，采用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法進(jìn)行MIC的測(cè)定。96 孔板內(nèi)第1至9列每孔中加入菌懸液100 μl， BHI培養(yǎng)液100 μl。第一孔內(nèi)加入TTO終濃度為2%，依次進(jìn)行二倍稀釋至終濃度0.031 25%，陽(yáng)性對(duì)照組含0.2%CHX，陰性對(duì)照組不加任何藥物，空白對(duì)照組加200 μl滅菌BHI培養(yǎng)液。37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。24 h后肉眼觀察，尚澄清孔所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。選取大于MIC濃度各組，每組隨機(jī)選一孔，取10 μl按1∶10 000稀釋，100 μl轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)，在平板上未觀察到菌落生長(zhǎng)的濃度為MBC[7]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)5 個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.2.3 TTO在對(duì)變異鏈球菌的抑菌率 將配置好的菌液分為7 組，用BHI將菌液濃度調(diào)整為為1×106cfu/ml，加入TTO終濃度分別為2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0.03125%，陽(yáng)性對(duì)照組加入0.2%CHX，陰性對(duì)照組不加任何藥液。37 ℃厭氧培養(yǎng)12、24、48 h后分別取樣，離心，PBS洗菌3 次，1 ml PBS重懸，加入96 孔板，MTT染色，避光培養(yǎng)4 h，離心，棄上清，加DMSO，溶解15 min后測(cè)吸光度，A=570，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%

1.2.2.4 TTO對(duì)變異鏈球菌殺菌時(shí)間 將制備好的菌液分別置于5 個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，加入TTO，終濃度為4MBC、2MBC、MBC、MIC、1/2 MIC，陽(yáng)性對(duì)照組加0.2% CHX，陰性對(duì)照組不加任何藥物。0、15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h后取樣，離心，棄上清。PBS洗菌3 次后重懸，4 ℃暫存，取樣結(jié)束后將所取樣本加入96 孔板內(nèi)，MTT進(jìn)行染色，方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 變異鏈球菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

變異鏈球菌生長(zhǎng)曲線如圖 1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，變異鏈球菌生長(zhǎng)周期為24 h，生長(zhǎng)8～12 h時(shí)處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。

圖 1 變異鏈球菌生長(zhǎng)曲線

2.2 TTO對(duì)游離變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響

2.2.1 TTO對(duì)變異鏈球菌抑菌環(huán)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1，5%TTO組，10%TTO組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t5%=14.190，P5%=0.000；t10%=8.093,P10%=0.000)。20%TTO組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.497,P=0.815)。

表 1 TTO 對(duì)變異鏈球菌抑菌環(huán)大小

2.2.2 TTO對(duì)變異鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC) TTO濃度為0.125%時(shí)，自然光下肉眼見(jiàn)96孔板澄清無(wú)渾濁，MIC為0.125%，將澄清孔按1∶10 000比例稀釋后涂板，0.25%TTO未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，MBC為0.25%。

2.2.3 TTO對(duì)變異鏈球菌的抑菌率 24 h內(nèi)，0.25%及以上濃度TTO均能完全殺滅細(xì)菌，抑菌率為100%。0.125%TTO抑菌率為90.97%±0.77%，69.94%±4.46%與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t12=7.390,P12=0.947；t24=4,627,P24=0.219)。0.06%TTO抑菌率為34.75%±9.96%,47.31%±5.60%，與對(duì)照組差與有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t12=8.926,P12<0.01；t24=10.601,P24=0.045)。0.03%TTO抑菌率為33.21%±1.36%，35.17%±5.80%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t12=58.196,P12<0.01；t24=13.828,P24=0.026)。

圖 2 不同濃度TTO在不同時(shí)間下對(duì)變異鏈球菌抑菌率

48 h時(shí)，0.5%TTO可完全殺滅細(xì)菌，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。濃度小于0.5%時(shí)，抑菌率分別為：68.63%±0.47%、61.72%±1.76%、46.72%±11.56%，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t0.25=1.715,P0.25=0.068；t0.125=7.30,P0.125=0.416；t0.06=1.01,P0.06=0.133)。0.03%TTO抑菌為43.15%±3.66%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t0.03=1.819，P0.03=0.046)(圖 2)。

2.2.4 TTO對(duì)變異鏈球菌的殺菌時(shí)間 當(dāng)TTO濃度大于等于0.25%時(shí)，均可在1 h內(nèi)完全殺滅細(xì)菌，0.125%TTO可在1 h內(nèi)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，此后12 h內(nèi)各組均未見(jiàn)明顯的細(xì)菌增殖現(xiàn)象。0.06%TTO在4 h內(nèi)達(dá)到抑菌效果，此后見(jiàn)細(xì)菌增殖現(xiàn)象(圖 3)。

圖 3 不同濃度TTO殺滅變異鏈球菌的工作時(shí)間

3 討 論

齲病作為一種危害人類口腔健康最常見(jiàn)的疾病，對(duì)口腔健康造成較大威脅。變異鏈球菌作為主要的致齲菌能在牙齒表面形成牙菌斑生物膜導(dǎo)致齲病的發(fā)生[8]。目前，控制變異鏈球菌生長(zhǎng)的藥物主要為化學(xué)性藥物，其中氟化物和氯己定的應(yīng)用最為廣泛。氟化物可以抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)，然而研究發(fā)現(xiàn)短暫的氟化物處理并不能維持對(duì)生物膜中變形鏈球菌的抗酸活性，損傷可以隨時(shí)間恢復(fù)[9]。此外，氟化物的廣泛應(yīng)用易引起耐氟菌株產(chǎn)生[10]，并且氟濃度穩(wěn)定性較差，過(guò)多或不當(dāng)使用可導(dǎo)致人體慢性氟中毒,產(chǎn)生氟斑牙、氟骨癥[11-12]。氯己定作為一種廣譜抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于口腔細(xì)菌的控制，但長(zhǎng)期使用廣譜抗菌劑易引起口腔菌群失調(diào)、使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、著色等問(wèn)題。此學(xué)者們將目光轉(zhuǎn)移到安全性更高的植物性抗菌藥。

TTO是從互葉白千層植物新鮮枝葉中提取得到的淡黃色液體，主要成分是單萜烯、醇類及倍半萜類化合物，約占總量的70%以上，其中4-萜烯醇和1,8-桉樹(shù)腦是茶樹(shù)精油抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[13]，主要通過(guò)破壞膜結(jié)構(gòu)，抑制微生物呼吸途徑中線粒體酶、脫氫酶活性，影響細(xì)胞呼吸作用，干擾胞內(nèi)大分子物質(zhì)活性等形式達(dá)到殺菌作用[14]。近年來(lái)，有研究證實(shí)TTO能控制菌斑生長(zhǎng)，抑制變異鏈球菌活性[15-16]，但現(xiàn)存的實(shí)驗(yàn)對(duì)TTO抑制變異鏈球菌的抑菌濃度、殺菌時(shí)間及作用效果等均未做出明確解釋，使得無(wú)法將TTO投入到臨床使用。本實(shí)驗(yàn)探究了TTO對(duì)變異鏈球菌的抑菌效果，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究不同濃度TTO對(duì)變異鏈球菌的抑菌率，并探究TTO的殺菌時(shí)間，為T(mén)TO精油的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)利用瓊脂盤(pán)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證明隨著濃度的增加，TTO對(duì)變異鏈菌抑菌環(huán)直徑呈劑量依賴性增大。20%TTO抑菌環(huán)直徑為(20.26±3.64) mm,與陽(yáng)性對(duì)照組(22.11±1.85) mm作用效果相當(dāng)。根據(jù)文獻(xiàn)可知，植物精油的抗菌活性可分為三級(jí)：抑制區(qū)≤12 mm，活性弱；12 mm<抑制區(qū)<20 mm，活性中等；抑制區(qū)≥20 mm，活性強(qiáng)[17]。因此20%TTO對(duì)變異鏈球菌抗菌活性較強(qiáng)。然而TTO溶解性差，揮發(fā)性較高[13],且在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散性受到時(shí)間，溫度等影響，抑菌效果會(huì)被低估，因此選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其抑菌效果加以佐證。

標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法得出TTO對(duì)變異鏈球菌的MIC為0.125%，MBC為0.25%，與Chandrdas等[18]的研究結(jié)果基本一致。抑菌率實(shí)驗(yàn)可知，當(dāng)TTO濃度大于等于MBC時(shí)，抑菌率為100%，與0.2%CHX效果相當(dāng)，當(dāng)TTO濃度小于MBC時(shí)，抑菌率呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢(shì)，隨著濃度的降低，TTO抑菌率逐漸降低。此外，TTO抑菌率也受時(shí)間的影響，高濃度下(>0.25%)48 h內(nèi)均可達(dá)到完全殺菌效果，0.25%TTO在48 h時(shí)已無(wú)法達(dá)到完全殺菌作用，0.125%TTO抑菌率也出現(xiàn)明顯降低，較低濃度(0.06%、 0.03%)抑菌效果隨時(shí)間變化不明顯。陽(yáng)性對(duì)照組0.2%CHX在48h時(shí)殺菌效果明顯降低，無(wú)法起到殺菌作用。由此可知當(dāng)0.5%TTO時(shí)殺菌效果較好，殺菌效果維持時(shí)間較長(zhǎng)，可作為臨床使用的參考濃度。

通過(guò)殺菌時(shí)間實(shí)驗(yàn)評(píng)估抗菌活性，驗(yàn)證細(xì)菌殺滅和再生長(zhǎng)的速率，殺菌范圍和時(shí)間，此方法是體外研究殺菌研究最常用的模型之一[19]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)TTO作用所需時(shí)間與藥物濃度沒(méi)有明顯相關(guān)性，各濃度在藥物作用1 h后效果均達(dá)到最佳。與氯己定相比所需時(shí)間較長(zhǎng)。猜想TTO作為植物性抑菌藥物，作用效果溫和，作用時(shí)間略長(zhǎng)，但作用效果更穩(wěn)定。此外，0.2%CHC殺菌過(guò)程中產(chǎn)生大量黃褐色沉淀黏附在管壁上難以清除，但實(shí)驗(yàn)組并未出現(xiàn)此情況，因此推測(cè)TTO能有效避免牙齒著色的問(wèn)題。

綜上所示，TTO作為一種殺菌劑，能有效抑制變異鏈球菌活性，起到殺滅變異鏈球菌的作用，殺菌所需濃度較低，作用溫和，效果穩(wěn)定。但TTO對(duì)變異鏈球菌結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響，以及其生物安全性并未明確，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究方向。