袁 慧，劉夢(mèng)雅，許文黎，胡 波，張亞娟，尹晶晶，岳 娟，李建國(guó)

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院藥物安全性評(píng)價(jià)中心，山西 太原 030006)

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)是一類結(jié)構(gòu)與胰島素相似的多肽，主要包括IGF-1 和IGF-2 兩類多肽類生長(zhǎng)因子，以及其相應(yīng)受體IGF-1R、IGF-2R 和至少6 種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding protein，IGFBP)。IGF 在各臟器中起著重要的代謝作用，控制各種細(xì)胞的增生、分化和凋亡進(jìn)程。由于IGF 在人體生命活動(dòng)中承擔(dān)著重要作用，所以電離輻射后它的表達(dá)變化顯得尤為重要[1-5]。前期本課題組已經(jīng)得出輻射后IGF基因表達(dá)的變化情況[6-8]，本文將從蛋白水平上研究照射后小鼠體內(nèi)胰島素生長(zhǎng)因子表達(dá)的變化。

本實(shí)驗(yàn)采用Western blot 方法檢測(cè)電子線照射小鼠后，小鼠肝臟中IGF1、IGF-1R、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達(dá)情況，為之后探討電離輻射對(duì)IGF 的影響及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c 雄性小鼠100 只，25～30 g，由中國(guó)食品藥品檢定研究院生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2014-013；中國(guó)輻射防護(hù)研究院GLP中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)管理，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(晉)2013-0002。

1.2 輻照源

電子線采用直線加速器6 MeV 照射，Elekta Synergy，英國(guó)Elekta Limited 公司生產(chǎn)，山西白求恩醫(yī)院放療科提供，源皮距為100 cm，劑量率為3 Gy/min。

1.3 儀器

臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)Heraeus instrumennts 公司生產(chǎn)；電動(dòng)勻漿機(jī)，CONNTROL公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)，ThermoFisher Scientific 公司生產(chǎn)；電泳儀PowerPacTMBasic，BIO-RAD 公司生產(chǎn)；轉(zhuǎn)膜儀Tras-Blot， BIO-RAD 公 司 生 產(chǎn)； 程 控 金 屬 浴Inanbator Thermoelectric公司生產(chǎn)。

1.4 試劑

哺乳動(dòng)物組織總蛋白提取試劑、小鼠anti-β-actin一抗、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、過(guò)硫酸銨Ammonium Persulfate，均購(gòu)自博士德生物工程有限公司；廣譜彩虹預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.5 動(dòng)物分組及照射

100 只雄性BALB/c 小鼠，隨機(jī)分為3 個(gè)不同劑量的電子線照射組(每組30 只)和1 個(gè)空白對(duì)照組(10 只)。照射組采用直線加速器全身照射小鼠，每次照射30只，照射劑量依據(jù)之前基因芯片篩選時(shí)的有效劑量設(shè)定，分別為1、2、4 Gy，劑量率為3 Gy/min。

1.6 Western blot檢測(cè)

1.6.1 總蛋白提取和濃度測(cè)定分別于照射后12、48、72 h將小鼠麻醉后摘取肝臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中漂洗數(shù)次后，稱取100 mg，加入蛋白裂解液(含1 μL PMSF)，用超聲破碎儀進(jìn)行組織勻漿。勻漿后靜置3 h，后離心取上清置于-20 ℃保存。按照BCA 法制備蛋白樣品，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的蛋白濃度。

1.6.2 進(jìn)行SDS-PAGE電泳按比例配制12%的分離膠和8%的濃縮膠，加入濃度為5 μg/μL的蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，采用恒壓的模式，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處停止。

1.6.3 轉(zhuǎn)膜SDS-PAGE 結(jié)束后，按照標(biāo)準(zhǔn)的“三明治”方法將條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST洗3次，采用濃度為5%的BSA封閉1 h，漂洗后放入一抗稀釋液孵育過(guò)夜。然后漂洗3 次，放入HRP標(biāo)志的二抗稀釋液中，室溫孵育2 h。

1.6.4 顯影將配制好的超敏ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜蛋白面充分接觸，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，積分光密度比值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 1 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

Western blot 檢測(cè)1 Gy 電子線照射后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果采用檢測(cè)蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin積分光密度的比值表示，見圖1 和表1。與對(duì)照組比較，照射后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IGF-1 蛋白的積分光密度比值除了照射后48 h 時(shí)＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白的表達(dá)情況相同，積分光密度比值均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，1 Gy電子線照射后，小鼠肝臟組織中IGF-1蛋白在照射后48 h 時(shí)表達(dá)增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋白在照射后12、48和72 h時(shí)表達(dá)均減少。

2.2 2 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測(cè)小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見圖2和表2。與對(duì)照組比較，照射后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IGF-1 蛋白和IGFBP4 蛋白的表達(dá)情況相同，與β-actin積分光密度的比值除了照射后48 h時(shí)＞1，其余均＜1(均為P＜0.05)；IGFBP1蛋白的積分光密度比值，在照射后12 h 時(shí)＞1，48、72 h 時(shí)＜1(P＜0.05)；IGF1R蛋白的積分光密度比值在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均＜1(均為P＜0.05)。由此可以看出，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1和IGFBP4蛋白在照射后48 h時(shí)表達(dá)增加，其余時(shí)間點(diǎn)為表達(dá)減少。IGFBP1蛋白在照射后12 h時(shí)表達(dá)增加，48和72 h時(shí)為表達(dá)減少。IGF1R蛋白在照射后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)為表達(dá)減少。

圖1 Western blot檢測(cè)1 Gy電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表1 1 Gy 電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

圖2 Western blot 檢測(cè)2 Gy 電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表2 2 Gy 電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 4 Gy 電子線照射后小鼠肝臟組織胰島素生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白表達(dá)情況

4 Gy 電子線照射后，Western blot 法檢測(cè)小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見圖3 和表3。與對(duì)照組比較，IGF-1、IGFBP1和IGFBP4蛋白的表達(dá)情況相同，與β-actin 積分光密度的比值，在照射后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均＜1(均為P＜0.05)；IGF1R 蛋白的積分光密度比值除了在照射后12 h 時(shí)＞1，48、72 h 時(shí)均＜1(均為P＜0.05)。由此可見，2 Gy電子線照射后，小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1和IGFBP4 蛋白均表達(dá)減少。IGF1R 蛋白在照射后12 h點(diǎn)為表達(dá)增加，48、72 h點(diǎn)均為表達(dá)減少。

圖3 Western blot 檢測(cè)4 Gy 電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)情況

表3 4 Gy 電子線照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中IGF-1、IGFBP1、IGFBP4和IGF1R蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ是多肽類生長(zhǎng)因子，與其相應(yīng)受體IGF-1R 結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖等生物學(xué)過(guò)程，參與機(jī)體大部分促生長(zhǎng)的代謝活動(dòng)。因此生命活動(dòng)的不同階段內(nèi)，IGF-1 在機(jī)體的大部分組織中均有表達(dá)，但主要的合成器官仍是肝臟[9-11]。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 與炎癥及肝纖維化進(jìn)展有重要關(guān)系，在炎癥的刺激下，肝細(xì)胞超表達(dá)IGF-1，IGF-1 促使肝細(xì)胞增殖，加強(qiáng)肝臟的合成和代謝功能，從而促進(jìn)炎癥的恢復(fù)[12-14]。但肝臟受到長(zhǎng)期損害，能夠表達(dá)IGF-1 的肝細(xì)胞減少，故IGF-1 水平降低。因此，肝臟中IGF-1 的含量是肝臟功能好壞的指標(biāo)之一。同時(shí)，由于肝臟是血液循環(huán)中IGF-1和IGFBPs的主要來(lái)源，肝臟受損時(shí)，IGF 系統(tǒng)會(huì)發(fā)生不同程度的改變，因此肝臟受損對(duì)IGF系統(tǒng)的影響也尤為重要。

本課題組前期利用基因芯片對(duì)60Co 射線照射的人肝細(xì)胞株進(jìn)行輻射相關(guān)基因的篩選，發(fā)現(xiàn)胰島素生長(zhǎng)因子家族中的基因差異表達(dá)顯著。因此選擇其為研究對(duì)象，對(duì)照射后人肝細(xì)胞株不同時(shí)間胰島素生長(zhǎng)因子基因表達(dá)水平的改變進(jìn)行了分析。本實(shí)驗(yàn)從動(dòng)物水平上觀察比較照射后不同時(shí)間小鼠肝臟中胰島素生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)從照射后不同時(shí)間點(diǎn)的角度分析可看出：①電子射線照射劑量為1 Gy時(shí)，照射后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，小鼠肝臟中4種蛋白表達(dá)總體呈現(xiàn)為表達(dá)減少。其中僅IGF-1 蛋白在照射后48 h 時(shí)表達(dá)增加，IGFBP1、IGFBP4 和IGF1R 蛋 白 在 照 射 后12、48 和72 h均表達(dá)減少。②照射劑量為2 Gy時(shí)，照射后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)IGF-1、IGFBP4和IGF1R蛋白表達(dá)趨勢(shì)總體為下調(diào)，其中IGF-1、IGFBP4 蛋白在照射后48 h 以及IGFBP1 蛋白在照射后12 h 表達(dá)增加，其余時(shí)間點(diǎn)均表達(dá)減少。IGF1R 蛋白在照射后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)為表達(dá)減少。③照射劑量為4 Gy 時(shí)，照射后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白的表達(dá)情況相同，均為表達(dá)減少；IGF1R蛋白除了在照射后12 h時(shí)表達(dá)增加，其余4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為表達(dá)減少。對(duì)比發(fā)現(xiàn)照射劑量為2 Gy 時(shí)IGF-1、IGFBP1 和IGFBP4 蛋白均出現(xiàn)了表達(dá)增加，IGF1R蛋白在照射劑量達(dá)到4 Gy時(shí)出現(xiàn)了表達(dá)增加。此4 種蛋白表達(dá)的情況與小鼠肝臟中基因表達(dá)情況相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因表達(dá)的結(jié)果，同時(shí)也表明電子輻射對(duì)胰島素生長(zhǎng)因子體系的影響是錯(cuò)綜復(fù)雜的，但總體表現(xiàn)為降低這4 種蛋白的表達(dá)。

上述4 種蛋白均屬于胰島素生長(zhǎng)因子家族中的一員，其中IGF-1 通過(guò)與IGF1R 結(jié)合來(lái)調(diào)控各種細(xì)胞的增生、分化和凋亡進(jìn)程，IGFBP1 與IGFBP4 主要用于運(yùn)輸和調(diào)節(jié)IGF-1，控制IGF-1 運(yùn)輸及代謝，調(diào)控IGF-1 定位于特定的組織及細(xì)胞上，決定IGF-1 的組織特異性[15-18]。肝細(xì)胞為4 種蛋白的主要分泌器官，TUNEL 法檢測(cè)到照射后6 h，小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，從側(cè)面印證了蛋白的下調(diào)表達(dá)結(jié)果。同時(shí)肝細(xì)胞在受到放射損傷后會(huì)立即進(jìn)入增殖修復(fù)的過(guò)程，IGFIR和IGF-1可以促進(jìn)這一修復(fù)過(guò)程。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)照射后IGF-1和IGF-1R蛋白表達(dá)下調(diào)，會(huì)影響到放射性損傷后肝組織的自我修復(fù)。

本研究利用Western blot 技術(shù)，采用電子線全身照射BALB/c 小鼠，觀察比較小鼠肝臟受到不同劑量照射及照射后不同時(shí)間點(diǎn)IGF-1R、IGFBP1、IGFBP4和IGF-1 蛋白表達(dá)水平的改變。結(jié)果表明，4 種基因和蛋白的表達(dá)水平基本上以下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)為主，可為研究輻射對(duì)肝臟的早期損傷提供依據(jù)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。