程萬莉，樊廷錄，2*，王淑英，李尚中，張建軍，趙剛，王磊，黨翼

（1.甘肅省旱作區(qū)水資源高效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究所，蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州730070）

微塑料（Microplastics，Mips）作為新型污染物正在成為備受關(guān)注的全球性環(huán)境問題[1]。因其比表面積大、吸附能力強(qiáng)、在環(huán)境中易于遷移和難以降解等特點(diǎn)在海洋或水體生態(tài)系統(tǒng)中得到廣泛研究[2-3]。通常把＜5 mm 的塑料顆粒稱為微塑料，其經(jīng)過物理、化學(xué)等作用會(huì)進(jìn)一步裂解成更小顆粒[4]。這些小顆粒更易吸附多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴等有機(jī)污染物及重金屬，也易被海洋生物誤食，造成危害[5-7]。迄今為止，有關(guān)微塑料的研究主要集中在海洋生態(tài)環(huán)境影響方面，許多學(xué)者已研究了其數(shù)量、來源、分布及毒理效應(yīng)，明確了微塑料在淡水水體及沉積物中的富集狀況[8]。由于土壤是一個(gè)復(fù)雜的三相體系，與海洋環(huán)境差異較大，難以直接將海洋環(huán)境中的研究思路和方法直接移植到土壤環(huán)境中，從土壤中獲取微塑料遠(yuǎn)比在水中獲取困難，致使土壤中微塑料相關(guān)研究工作進(jìn)展緩慢。另外土壤中存在大量塑料碎片是司空見慣的現(xiàn)象，這在很大程度上也是導(dǎo)致土壤中微塑料積累研究被忽視的原因之一。Nizzetto 等[9]估算北美和歐洲每年排放約11 萬～73 萬t 微塑料到農(nóng)田土壤中，大大超過了對(duì)海洋中微塑料的估計(jì)量。農(nóng)田土壤微塑料研究才剛起步，已有研究顯示，上海城郊菜地土壤中微塑料主要分布在淺層土壤[10]，黑龍江農(nóng)田土壤0～20 cm 微塑料顆粒大小分布在60～2 400 μm 之間[11]，云南滇池南部湖盆區(qū)0～10 cm 表層每千克土壤微塑料數(shù)量近2 萬片[12]。在高強(qiáng)度地膜覆蓋的我國西北地區(qū)，農(nóng)田土壤中肉眼可見地膜殘片（直徑＞5 mm）被認(rèn)為是土壤微塑料的最主要來源[13]，但土壤微塑料數(shù)量和分布特征的研究還較少。由于對(duì)農(nóng)田土壤微塑料本底值和科學(xué)認(rèn)知研究的不充分，也就難以評(píng)估微塑料對(duì)農(nóng)田土壤健康以及生產(chǎn)力的潛在危害。

環(huán)境樣品中微塑料的分離提取是微塑料污染研究的關(guān)鍵。目前，水面漂浮微塑料主要通過過濾收集[14]；沉積物或土壤等固體樣品通常采用篩分-浮選相結(jié)合進(jìn)行分離收集，或者直接通過密度浮選法[15-17]，并結(jié)合加熱法，用顯微鏡觀察加熱前后微塑料的變化，該方法簡單、方便、成本低廉，不需化學(xué)試劑就能有效地鑒別微塑料。近年來，拉曼光譜或紅外線、掃描電鏡-能譜法、裂解氣相色譜-質(zhì)譜法等也被用于識(shí)別和量化土壤中微塑料形態(tài)與組成結(jié)構(gòu)的變化[1]，但成本高、耗時(shí)長。地膜覆蓋是甘肅和陜北等西北干旱半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增效的重大技術(shù)措施，已應(yīng)用20 多年，甘肅是僅次于新疆全國地膜覆蓋面積最大的省份之一，全省一半耕地已地膜化，地膜污染形勢(shì)嚴(yán)峻。因此，本研究采集該區(qū)域9個(gè)縣區(qū)27塊典型覆膜農(nóng)田0～30 cm 土壤樣品，參考Zhang 等[18]提出的密度浮選和加熱分離法提取和甄別農(nóng)田土壤微塑料，結(jié)合電子顯微鏡和Image J 軟件計(jì)算微塑料豐度（每千克干土中微塑料數(shù)量，pieces·kg-1）和面積（每個(gè)微塑料面積，mm2·piece-1），旨在闡明西北典型覆膜農(nóng)田微塑料數(shù)量及分布特征，為農(nóng)田土壤微塑料研究提供參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

甘肅和陜西北部是我國地膜覆蓋面積及覆蓋強(qiáng)度較大的地區(qū)之一，氣候由西部的干旱綠洲灌區(qū)到東部的半干旱雨養(yǎng)區(qū)，長期盛行一年一熟或兩年三熟（夏休閑期復(fù)種）輪作制，農(nóng)田地膜覆蓋量平均75 kg·hm-2。2018年9—11月作物收獲后，用GPS 定位甘肅和陜北9個(gè)縣區(qū)27塊典型覆膜農(nóng)田的地理位置，調(diào)查種植作物和覆膜年限，結(jié)果見表1。在作物收獲后揭掉地表當(dāng)季覆蓋塑料薄膜后、農(nóng)田土壤未翻耕前采集土樣，每個(gè)地塊根據(jù)面積大小和形狀選取3 個(gè)樣方作為采樣點(diǎn)，總共采集81個(gè)樣點(diǎn)的土壤樣品（27×3）。每個(gè)采樣點(diǎn)用鐵簽作為四角支撐點(diǎn)連成一個(gè)100 cm×100 cm 的正方形，逐層仔細(xì)撿拾0～30 cm 深土壤樣品中肉眼可見的殘膜碎片（數(shù)據(jù)單獨(dú)公開發(fā)表）。同步采集土壤樣品，將每次采集的土壤均勻混合，用四分法取2 kg 土壤樣品標(biāo)記后裝入布袋，共81 份帶回實(shí)驗(yàn)室處理并進(jìn)行微塑料提取。

1.2 微塑料提取

采集的土壤樣品在實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干后，進(jìn)一步除去肉眼可見的塑料殘片、作物根系、石塊等雜質(zhì)后，采用密度-蒸餾水浮選法提取81 個(gè)土壤樣品中的微塑料。（1）每個(gè)樣品稱取10.00 g 土壤放入100 mL 燒杯中，加入蒸餾水50 mL，室溫下用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，用蒸餾水把玻璃棒上的黏附物沖洗到燒杯中，蓋上錫箔紙，靜置24 h，讓土壤顆粒沉淀，得到均勻懸浮液；（2）用慢速定量濾紙（孔徑＜3 μm）過濾懸浮液到準(zhǔn)備好的三角瓶中，然后再加50 mL 蒸餾水到燒杯中，繼續(xù)用玻璃棒攪拌并用蒸餾水沖洗玻璃棒，蓋上錫箔紙?jiān)凫o置24 h；（3）重復(fù)（2）操作至少4 次，使微塑料等物質(zhì)吸附到濾紙上，直至原有燒杯上清液中無肉眼可見漂浮物；（4）將燒杯移至超聲波清洗機(jī)中振蕩2 h，以充分釋放包裹于土壤顆粒中的微塑料，取出靜置24 h 后過濾；（5）將（4）得到的懸浮液繼續(xù)用（2）中濾紙過濾吸附微塑料等，然后將濾紙仔細(xì)折疊，放在錫箔紙杯中，于60 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量。為防止環(huán)境背景造成污染，實(shí)驗(yàn)人員穿棉質(zhì)衣服，操作在封閉環(huán)境中進(jìn)行。

表1 甘肅省和陜西北部27個(gè)采樣點(diǎn)的基本信息Table 1 Basic informations of 27 sampling sites in Gansu and North Shaanxi

1.3 微塑料鑒別與大小計(jì)算

拍照：用毛刷子將濾紙上收集的微塑料等物質(zhì)全部轉(zhuǎn)移到載玻片上，并使其均勻分散不重疊，載玻片置于顯微鏡（Olympus CX41）下觀察，并用連接于電腦的拍照系統(tǒng)（Q-Capture Pro7）拍攝照片記為1（圖1A），然后保持顯微鏡和拍攝參數(shù)不變，將載玻片轉(zhuǎn)移到恒溫電熱板（崢嶸DB-1A），130 ℃下加熱4～8s使微塑料變形；將載玻片放回顯微鏡拍下加熱后微塑料照片記為2（圖1B）。拍照全過程實(shí)驗(yàn)人員戴帽子和口罩，穿棉質(zhì)衣服。

識(shí)別：在Photoshop CS6 中將照片1 和2 疊加比對(duì)，加熱前后發(fā)生形態(tài)變化的即為微塑料，形態(tài)未變化的為土壤顆粒中分離出來的有機(jī)物、石塊等雜質(zhì)。將照片1 中加熱后未變形的物質(zhì)擦除，變形的微塑料命名為N1 保存。將N1 導(dǎo)入Image J 中統(tǒng)計(jì)微塑料的數(shù)量（豐度）和每個(gè)微塑料的像素值，用照片分辨率（300 dpi）和像素（2 560×1 920）、微塑料像素值、顯微鏡放大倍數(shù)40（目鏡10×、物鏡4×）計(jì)算每個(gè)微塑料的面積。

分組：土壤中微塑料經(jīng)各種生物、化學(xué)和物理因素作用后呈碎片、纖維和薄膜等不同形態(tài)，單純用粒徑長度尚不能充分反映微塑料顆粒的實(shí)際大小。已有研究以每個(gè)微塑料最長邊的長度作為粒徑分級(jí)，或用每千克干土中微塑料的毫克數(shù)來衡量微塑料含量[1，18]。本研究81份土壤樣品（共取2 430 g干土）共檢測(cè)到12 392 個(gè)微塑料，以每個(gè)微塑料面積（mm2）大小，將其劃分為0～0.05、0.05～0.3、0.3～0.6、0.6～1.0 mm2·piece-1和＞1.0 mm2·piece-1共5 個(gè) 組。每 個(gè) 監(jiān) 測(cè)點(diǎn)每千克干土中微塑料面積為監(jiān)測(cè)到所有微塑料面積之和。

1.4 數(shù)據(jù)分析

微塑料豐度和面積以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（Mean±SE）。因受氣候、土壤、耕作管理、物理化學(xué)等綜合因素影響，土壤中微塑料豐度和大?。娣e）呈現(xiàn)明顯的非均勻偏態(tài)分布，不符合參數(shù)檢驗(yàn)和方差分析要求，用SPSS 22.0和Excel作直方圖和頻數(shù)分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)田土壤中微塑料豐度及大小

土壤中微塑料數(shù)量一般用其豐度表示，即每千克干土中微塑料豐度（pieces·kg-1），面積為每千克土壤中所有微塑料對(duì)應(yīng)面積的和（mm2·kg-1）。結(jié)果表明，甘肅和陜北9 個(gè)縣區(qū)27 塊典型農(nóng)田81 個(gè)土壤樣方中均檢測(cè)到微塑料的存在，并且不同地塊之間、同一地塊不同取樣點(diǎn)之間微塑料豐度和面積差異較大（圖2）。農(nóng)田0～30 cm 土層微塑料豐度平均值（5.09±1.21）×103pieces·kg-1，變異系數(shù)68.4%，最小為5.80×102pieces·kg-1，最大為1.19×104pieces·kg-1，最大值與最小值相差約20 倍（圖2A）。農(nóng)田土壤微塑料面積平均值（1.04±0.20）×103mm2·kg-1，變異系數(shù)89.4%，最小為82 mm2·kg-1，最大為4.16×103mm2·kg-1，相差約50倍（圖2B）。長期覆膜農(nóng)田土壤中微塑料面積變異顯著大于其豐度變異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，干旱綠洲灌區(qū)（甘肅張掖和武威）、半干旱雨養(yǎng)區(qū)（甘肅中東部）、風(fēng)沙半干旱灌區(qū)（陜西北部）微塑料豐度平均值依次為2.02×103、6.90×103、3.63×103pieces·kg-1，微塑料面積為1.8×102、1.36×103、7.6×102mm2·kg-1，微塑料平均面積為0.11、0.20、0.23 mm2·piece-1，即半干旱雨養(yǎng)區(qū)土壤微塑料豐度和面積明顯高于干旱綠洲灌區(qū)和風(fēng)沙半干旱灌區(qū)，但干旱綠洲灌區(qū)和風(fēng)沙半干旱灌區(qū)微塑料平均面積卻小于半干旱雨養(yǎng)區(qū)，表明微塑料在土壤中的存在狀況和大小可能受氣候與灌溉條件、土壤耕作等綜合因素影響。

圖1 顯微鏡下拍攝的土壤微塑料加熱前后形態(tài)變化（圖中圓圈中的為微塑料）Figure 1 Change of MiPs shapes from photos taken by camera under microscope（MiPs were circled）

2.2 農(nóng)田土壤微塑料豐度和大小的分布特征

27 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的81 個(gè)土壤樣品（共2 430 g 干土）中共檢測(cè)和甄別到12 392 個(gè)微塑料顆粒。81 份土壤樣品中的微塑料豐度及檢測(cè)到所有微塑料顆粒面積大小均呈現(xiàn)明顯的不均勻分布（圖3）。總體來看，土壤中豐度較小的微塑料出現(xiàn)次數(shù)較多，面積越小的微塑料出現(xiàn)次數(shù)越多。0～30 cm 土層中微塑料豐度＜3×103pieces·kg-1和3×103～8×103pieces·kg-1出現(xiàn)的次數(shù)最高（圖3A），分別為30次和32次，占總次數(shù)的38.4%和41.0%，即每千克土壤中微塑料豐度＜8 000 pieces·kg-1的占79.4%，＜3 000 pieces·kg-1與3 000～8 000 pieces·kg-1的所占比例接近。

圖2 甘肅和陜西27個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)0～30 cm土層微塑料豐度和面積的變化Figure 2 The abundance and area of MiPs in 0～30 cm soil layer at 27 sampling sites in Gansu and Shaanxi

圖3 甘肅和陜西27個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)0～30 cm土層微塑料豐度和大小的頻次分布Figure 3 Frequency distribution of the abundance and area of MiPs in 0～30 cm soil layer in Gansu and Shaanxi

檢測(cè)到的所有微塑料中，每個(gè)微塑料顆粒平均面積0.19 mm2·piece-1，最大7.11 mm2·piece-1，變異系數(shù)為174.7%。從每個(gè)微塑料面積大小出現(xiàn)次數(shù)的頻數(shù)分布來看（圖3B），檢測(cè)到的微塑料可分為5 個(gè)組，其中＜0.05 mm2·piece-1和0.05～0.3 mm2·piece-1出 現(xiàn) 的次數(shù)為4 584 次和5 643 次，占微塑料總數(shù)的36.9%和45.5%，大小在0～0.3 mm2·piece-1范圍內(nèi)的微塑料出現(xiàn)總次數(shù)占82.4%，即土壤中面積＜0.3 mm2·piece-1的微塑料居多。而大小在0.3～0.6、0.6～1.0 mm2·piece-1和＞1.0 mm2·piece-1范圍內(nèi)微塑料出現(xiàn)次數(shù)分別占10.5%、4.2%和2.9%（表2）。特別是面積小于平均數(shù)（0.19 mm2·piece-1）的微塑料出現(xiàn)次數(shù)所占比例高達(dá)74.6%。在5 個(gè)分組范圍內(nèi)，面積0～0.05 mm2·piece-1的微塑料面積占比僅8.7%，顯著低于對(duì)應(yīng)范圍內(nèi)的微塑料豐度占比（36.9%），0.05～0.3 mm2·piece-1范圍內(nèi)的微塑料面積占比達(dá)到36.5%，0.3～0.6、0.6～1.0 mm2·piece-1和＞1.0 mm2·piece-1范 圍 內(nèi) 的 面 積 占 比 卻高于相應(yīng)分組內(nèi)的微塑料豐度占比（表2）。即覆膜農(nóng)田土壤中微塑料豐度隨其面積減小而增大，面積小的微塑料豐度較大（圖3）。

2.3 農(nóng)田覆膜年限與微塑料豐度和大小的關(guān)系

經(jīng)調(diào)研農(nóng)戶地膜覆蓋年限，甘肅和陜北27 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)中地膜覆蓋時(shí)間最短的是4 a，最長的是28 a，其中14 個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)覆膜年限在10～20 a（表1）。農(nóng)田覆膜年限長短對(duì)土壤中微塑料豐度和大小影響較大（表3）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，面積為0～0.05 mm2·piece-1的微塑料豐度占比由覆膜5 a 的31.8%增加到覆膜10 a 的44.5%、15 a 的49.5%和28 a 的57.6%，相應(yīng)覆膜年限微塑料面積所占比例依次為2.8%、5.8%、13.4%和18.8%；覆膜年限對(duì)面積0.05～0.3 mm2·piece-1微塑料豐度占比影響不明顯，而對(duì)其面積占比影響同0～0.05 mm2·piece-1微塑料的變化情況基本一致，隨覆膜年限增加微塑料面積占比顯著提高。然而，面積為0.3～0.6、0.6～1.0、＞1.0 mm2·piece-1微塑料隨著覆膜年限延長，其豐度和面積所占比例均下降（表3）。隨著覆膜年限的增加，土壤中小顆粒微塑料豐度和面積所占比例均明顯增加，可以推斷長期覆膜后農(nóng)田土壤中積累的微塑料由大顆粒逐漸向小顆粒轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致小顆粒微塑料所占面積增加、比表面積增大，這可能會(huì)加重微塑料對(duì)土壤的潛在污染。

表2 覆膜農(nóng)田土壤微塑料分組及其微塑料豐度和面積占比變化Table 2 Area groups of MiPs and percentage of number and area in the corresponding groups

表3 農(nóng)田覆膜年限對(duì)不同分組內(nèi)土壤微塑料豐度和面積占比的影響Table 3 Effects of mulch years on the numbers and areas of MiPs in different area groups

3 討論

土壤中微塑料數(shù)量和大小受氣候環(huán)境、灌溉條件、土壤耕作強(qiáng)度、自然風(fēng)化、覆膜年限等綜合因素影響，全球不同區(qū)域研究中數(shù)據(jù)差異很大。意大利地中海沿海區(qū)域微塑料豐度2 175 pieces·kg-1[19]，新加坡紅樹林土壤中為（62.8±27.2）pieces·kg-1[20]，瑞士自然保護(hù)區(qū)土壤為593 pieces·kg-1[21]，我國黑龍江周邊農(nóng)田微塑 料 豐 度 最 大 為800 pieces·kg-1、面 積 為1.1～12.6 mm2·kg-1[11]，云南滇池南部湖盆區(qū)0～10 cm 土壤微塑料數(shù)量1.3×104～2.8×104pieces·kg-1[12]，覆膜20 a 后內(nèi)蒙古河套灌區(qū)土壤微塑料豐度高達(dá)6 262.5 pieces·kg-1[22]。本研究甘肅和陜北覆膜農(nóng)田0～30 cm 土壤微塑料豐度和面積大小呈現(xiàn)非均勻分布，豐度和面積平均值分別為（5.09±1.21）×103pieces·kg-1和（1.04±0.20）×103mm2·kg-1，這些初步結(jié)果預(yù)示著西北覆膜農(nóng)田土壤微塑料污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)很大，并且半干旱雨養(yǎng)區(qū)微塑料數(shù)量和面積大于河西與陜北的干旱半干旱灌區(qū)，這可能是由于灌溉使部分微塑料隨水分入滲逐漸遷移到30 cm 以下土層，旱作區(qū)土壤水分不足且頻繁干濕交替致使微塑料移動(dòng)性較差，或許也與土壤類型、耕作措施等有關(guān)，但目前這些尚缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)佐證，僅是推測(cè)，亟待后續(xù)深入研究。

在不同粒徑的微塑料中，土壤中＜1 mm 的微塑料所占比例較高[23-24]。內(nèi)蒙古河套灌區(qū)覆膜20 a 的農(nóng)田土壤微塑料粒徑＜1、1～3 mm 的比例達(dá)到52.1%、31.9%，覆膜5～10、10～20 a 農(nóng)田土壤微塑料數(shù)量年平均增長14.46%、3.95%[22]。Zhao 等[25]在中國長江入?？谒w中觀測(cè)到的＜1 mm 的微塑料豐度占50%。大量研究表明，這些更細(xì)小的微塑料（1 mm 左右或μm級(jí)）更容易進(jìn)入生物體組織甚至細(xì)胞中，土壤中微塑料比表面積大小與土壤中有機(jī)污染物和重金屬吸附有關(guān)，面積越小遷移能力越強(qiáng)[26-28]，遷移過程中微塑料老化和磨損又會(huì)使比表面積增加，放大生態(tài)毒性[29]。本研究農(nóng)田土壤微塑料大小平均0.19 mm2·piece-1，＜0.3 mm2·piece-1的數(shù)量占82.4%、面積占45.2%，＜0.1 mm2·piece-1的微塑料數(shù)量占57.8%，特別是 在0～0.05 mm2·piece-1和0.05～0.3 mm2·piece-1范 圍內(nèi)，覆膜28 a 農(nóng)田土壤微塑料豐度較覆膜5 a 增加了44.9% 和10.4%，相應(yīng)的微塑料面積占比增加了85.2%和68.0%，面積越小的微塑料其數(shù)量所占比例增加，面積越大的微塑料其數(shù)量所占比例減少。這可能是因?yàn)殡S覆膜時(shí)間增加大粒徑微塑料向小粒徑轉(zhuǎn)化，小粒徑微塑料通過生物體的能力會(huì)越強(qiáng)，將威脅土壤動(dòng)物和植物的正常生長。因此，土壤中＜0.3 mm2·piece-1的微塑料是造成微塑料污染的主要組分，需要更加關(guān)注這些豐度較高、顆粒更細(xì)的微塑料研究，加強(qiáng)農(nóng)田微塑料在土壤中遷移、轉(zhuǎn)化特征及其可能產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究，以為西北適宜地膜覆蓋區(qū)域土壤殘膜管理措施制定提供依據(jù)。

4 結(jié)論

西北作為我國地膜用量和覆蓋面積最大的地區(qū)，覆膜農(nóng)田普遍存在著土壤微塑料，并且數(shù)量較高，0～30 cm 土層每千克干土中微塑料豐度和面積為（5.09±1.21）×103pieces 和（1.04±0.20）×103mm2，微塑料平均大小0.19 mm2·piece-1。長期覆膜農(nóng)田面積＜0.3 mm2·piece-1的微塑料數(shù)量占82.4%、面積占45.2%，特別是＜0.01、＜0.1 mm2·piece-1范圍內(nèi)的微塑料數(shù)量占4.5%、57.8%，即土壤微塑料主要以微米級(jí)存在。隨著地膜覆蓋時(shí)間延長，農(nóng)田土壤中＜0.3 mm2·piece-1的微塑料數(shù)量和面積所占比例均明顯增加，＞0.3 mm2·piece-1的微塑料數(shù)量和面積占比卻下降，預(yù)示著大顆粒會(huì)逐漸向小顆粒轉(zhuǎn)化，一定時(shí)期內(nèi)農(nóng)田土壤微塑料潛在污染將呈現(xiàn)出加重趨勢(shì)。