孫躍峰,江 劍,王 玲,王 宏

(1．大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 脊柱外科,遼寧 大連 116011；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 微創(chuàng)脊柱外科,廣東 廣州 510000；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤科,遼寧 大連 116011)

腫瘤的發(fā)病率和死亡率在全世界范圍內(nèi)正逐年增加，成為威脅公眾健康的主要原因之一。一項(xiàng)調(diào)查顯示，從2002年到2012年，全球腫瘤發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)分別增加到1400萬(wàn)和827萬(wàn)左右[1]。2015年，中國(guó)大約有430萬(wàn)腫瘤新診斷病例以及280萬(wàn)人死于惡性腫瘤，相當(dāng)于平均每天有1.2萬(wàn)人被診斷患有腫瘤以及7.5萬(wàn)人死于惡性腫瘤[2]。因此，更加全面地理解腫瘤的發(fā)生、增殖以及轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制成為治療腫瘤的關(guān)鍵。近年來(lái)有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境(tumor environment，TME)在腫瘤增殖和進(jìn)展中具有不可替代的作用[3]。腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞成分及非細(xì)胞成分組成。其中細(xì)胞成分包括內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，EC)、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)、轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞(transformed epithelial cells，TEC)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)等，它們與腫瘤細(xì)胞相互作用，影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等生物學(xué)特性[4-12]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子等非細(xì)胞成分在促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活、誘導(dǎo)其他細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)遷移等方面發(fā)揮著重要作用[13-14]。與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(two-dimensional cell culture，2DCC)不同，三維細(xì)胞培養(yǎng)(three-dimensional cell culture,3DCC)能夠模擬真實(shí)的細(xì)胞異質(zhì)性以及細(xì)胞微環(huán)境，并且提供了細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)相互作用的信息，為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及分子靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證提供了新方法[15-19]。

1 無(wú)支架的3DCC

無(wú)支架的3DCC是由多種不同類(lèi)型的細(xì)胞自發(fā)聚集而產(chǎn)生的細(xì)胞球狀體。該技術(shù)適用于培養(yǎng)分泌ECM蛋白并能自組裝成三維組織樣結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞，如炎性乳腺癌細(xì)胞。與基于支架的3DCC相比，無(wú)支架的多細(xì)胞腫瘤球體由排列松散的細(xì)胞組成，纖維連接蛋白均勻分布于整個(gè)球體內(nèi)[20-21]。

1.1 液體覆蓋法

1.1.1 瓊脂糖包被培養(yǎng)板

Charoen等[26]利用瓊脂糖包被的96孔板分別培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞，隨后將多細(xì)胞腫瘤球體嵌入膠原凝膠中，并對(duì)整個(gè)球狀體和單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量和定性分析。作者認(rèn)為，該模型結(jié)合了腫瘤細(xì)胞球狀體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，在以往三維球狀體模型成功的基礎(chǔ)上，擴(kuò)展了將單個(gè)大小可控的球狀體作為腫瘤模型嵌入膠原凝膠的制備方法。此方法將促進(jìn)對(duì)腫瘤細(xì)胞行為的研究，提高對(duì)新型抗腫瘤藥物的評(píng)價(jià)，加快具有數(shù)據(jù)建模和預(yù)測(cè)功能的仿真軟件的開(kāi)發(fā)。Geiger等[27]為了檢測(cè)galectin-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡潛能、代謝活性以及它們對(duì)TF(Thomsen-Friedenreich)腫瘤抗原表達(dá)依賴(lài)性的影響，用同樣的培養(yǎng)方法對(duì)MCF-7和T-47D兩種乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了體外三維培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，在單層細(xì)胞以及球狀體細(xì)胞培養(yǎng)模型中，galectin-1能夠抑制高表達(dá)TF抗原的乳腺癌細(xì)胞的增殖和代謝活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.1.2 Poly-HEMA包被培養(yǎng)板

Kuen 等[28]為了確定誘導(dǎo)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制，建立了胰腺癌細(xì)胞、CAFs和單核細(xì)胞的三維共培養(yǎng)模型。在poly-HEMA包被的6孔板中，每孔接種2.5×105個(gè)腫瘤細(xì)胞用于單層細(xì)胞培養(yǎng)，每孔1×105個(gè)腫瘤細(xì)胞以及1.5×105個(gè)MRC-5成纖維細(xì)胞用于共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子，并且這些細(xì)胞因子可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞和骨髓源抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressive cells，MDSCs)的極化。這些共培養(yǎng)的多細(xì)胞球狀體具有抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖等免疫抑制功能，而這種功能可以被精氨酸酶1(arginase-I)等免疫抑制因子阻斷劑所部分逆轉(zhuǎn)。Choe等[29]用同樣的方法對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行體外三維培養(yǎng)以及傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，目的是為了確定一種名為“SOX2”的多能調(diào)節(jié)因子在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的作用。作者認(rèn)為，SOX2在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)疾病進(jìn)展期間通過(guò)其下游信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)AKT激酶促進(jìn)錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)和化學(xué)抵抗性，使得SOX2可能成為治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。

1.1.3 超低結(jié)合培養(yǎng)板

Gebhard等[30]利用超低結(jié)合培養(yǎng)板建立了一個(gè)由犬骨肉瘤細(xì)胞構(gòu)建的無(wú)支架三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并通過(guò)光鏡和電鏡對(duì)多細(xì)胞球狀體和單層細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較。他們發(fā)現(xiàn)，多細(xì)胞球狀體顯示出獨(dú)特的I型膠原網(wǎng)絡(luò)，比單層培養(yǎng)物更接近真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境。此外，球狀體壞死中心存在大量骨鈣素，而周邊區(qū)域則以細(xì)胞增殖為主。說(shuō)明犬骨肉瘤細(xì)胞所構(gòu)建的無(wú)支架三維多細(xì)胞球狀體相比單層細(xì)胞，能更好地模擬體內(nèi)腫瘤結(jié)構(gòu)，尤其是細(xì)胞—細(xì)胞及細(xì)胞—細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用。Pang等[31]成功地從原發(fā)性犬骨肉瘤和已建立的細(xì)胞系中分離出癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)，并且發(fā)現(xiàn)它們可以在6孔超低結(jié)合培養(yǎng)板中形成腫瘤球狀體以及對(duì)化療藥物具有耐藥性。進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)分離的骨肉瘤干細(xì)胞和子代黏附細(xì)胞的基因表達(dá)譜存在顯著差異，且環(huán)氧合酶-2(COX-2)在CSCs腫瘤球狀體中的表達(dá)量是子代黏附細(xì)胞的141倍。COX-2抑制劑對(duì)CSCs的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，卻對(duì)子代細(xì)胞球狀體的形成起到了抑制作用，這表明COX-2在腫瘤起始過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

1.2 懸滴法

懸滴法是無(wú)支架培養(yǎng)三維多細(xì)胞腫瘤球體最廣泛使用的方法之一，因懸浮細(xì)胞在液滴中由于重力原因自發(fā)聚集成細(xì)胞球狀體而得名[32]。多細(xì)胞腫瘤球體的大小可根據(jù)懸浮細(xì)胞密度決定，細(xì)胞接種以后將培養(yǎng)板倒置，由于表面張力細(xì)胞懸液變成細(xì)胞懸滴保持在適當(dāng)位置不動(dòng)，細(xì)胞在液滴與空氣界面處的液滴尖端積聚并增殖[33]。

Amann等[34]采用與自動(dòng)化兼容的多孔懸滴微滴板，將NSCLC的兩種細(xì)胞系A(chǔ)549和COLO-699分別與肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行三維單培養(yǎng)或共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，與共培養(yǎng)相比，A549在單培養(yǎng)中存活率較低；而COLO-699則在單培養(yǎng)中存活率較高。同時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中兩種細(xì)胞系的波形蛋白表達(dá)量增加，E-鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)量減少。 Raghavan等[35]采用一種新穎的體外三維細(xì)胞培養(yǎng)模型：在新型384孔懸滴陣列培養(yǎng)板中將10個(gè)卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)成單個(gè)球狀體。他們認(rèn)為，在高通量384孔板中，極少的細(xì)胞數(shù)量便可產(chǎn)生卵巢癌細(xì)胞球狀體，且具有較高的存活率。相比于傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)，細(xì)胞球狀體表現(xiàn)出更高的耐藥性。

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2 基于支架的3DCC

參與多細(xì)胞腫瘤球體形成的生物活性支架通常包括天然材料以及合成材料，它們不僅支撐腫瘤細(xì)胞的三維組織結(jié)構(gòu)，而且促進(jìn)細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)之間的相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖和聚集[36-37]。常見(jiàn)的天然支架材料有膠原、藻酸鹽、殼聚糖、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、粘多糖等[38-39]。相比于合成支架，天然支架具有更好的生物兼容性，但機(jī)械強(qiáng)度不如合成支架[40]。常見(jiàn)的合成支架材料有聚羥基酸、聚羥基丁酸酯、聚羥基酮、聚羥基丁酸酯—共羥基戊酸酯等，它們具有比天然支架更高的機(jī)械強(qiáng)度，可用于剛性支架的構(gòu)建[41]。

2.1 天然支架

2.1.1 藻酸鹽

Akeda等[42]采用一種新型小鼠骨肉瘤三維藻酸鹽球形培養(yǎng)系統(tǒng)，將兩種具有高肺轉(zhuǎn)移潛力的細(xì)胞系Dunn及LM8包埋在藻酸鹽珠中，探究人類(lèi)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)，LM8細(xì)胞系中分離細(xì)胞的數(shù)量高于Dunn細(xì)胞系。在體內(nèi)藻酸鹽珠轉(zhuǎn)移模型中，LM8細(xì)胞比Dunn細(xì)胞有更高的肺轉(zhuǎn)移率。該培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞特征和動(dòng)力學(xué)反映了其在體內(nèi)的惡性潛能。

2.1.2 基質(zhì)膠及膠原

Elenjord等[43]利用三維纖絲原纖維和二維單聚體膠原體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，探究細(xì)胞膠原I相互作用對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)合成和活化，以及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)合成的影響。他們發(fā)現(xiàn)，MMP-2的合成和活化受骨肉瘤細(xì)胞與I型膠原相互作用的影響。 Gorska等[44]在基質(zhì)膠中培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系來(lái)探究有限氧滲透對(duì)氮氧化應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)的影響。他們?cè)跈z測(cè)了細(xì)胞活力、氮氧化應(yīng)激標(biāo)志物及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)后認(rèn)為，商業(yè)細(xì)胞株對(duì)低氧高度敏感，低氧條件可誘導(dǎo)細(xì)胞環(huán)境氧化，因此可能無(wú)法構(gòu)成良好的骨組織工程三維培養(yǎng)模型。Kim等[45]同樣利用基質(zhì)膠對(duì)膀胱癌細(xì)胞的兩種細(xì)胞系SBT31A 和T24進(jìn)行體外三維培養(yǎng)。他們研究了細(xì)胞周期蛋白D1b(cyclin D1b)小干擾RNA(siRNA)對(duì)表達(dá)cyclin D1b 信使RNA(mRNA)的人膀胱癌細(xì)胞系SBT31A和T24的抑癌作用，發(fā)現(xiàn)抑制cyclin D1b的表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞干性及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的惡性表型。Alshareeda等[46]利用基質(zhì)膠將絨毛膜來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(chorionic villi derived mesenchymal stem cells，CVMSCs)與三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)細(xì)胞系MDA-MB-231共培養(yǎng)，建立了體外三維共培養(yǎng)模型。他們觀察到，在MDA-MB-231與CVMSCs共培養(yǎng)體系中加入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，不僅抑制了HUVECs的血管生成能力和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖遷移能力，而且降低了MDA-MB-231特征性細(xì)胞因子的表達(dá)。

2.1.3 絲素蛋白

Talukda等[47]利用絲素蛋白支架實(shí)現(xiàn)了人乳腺癌細(xì)胞與人成骨樣細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的三維共培養(yǎng)。這種支架材料在結(jié)構(gòu)上比其他天然生物材料更耐蛋白酶降解。他們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞與成骨樣細(xì)胞通過(guò)分泌產(chǎn)物相互作用，成骨樣細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)礦化，并且共培養(yǎng)細(xì)胞在耐藥性、侵襲性和血管生成性方面有顯著提高。

2.1.4 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸同樣也可以作為構(gòu)建體外三維培養(yǎng)模型的支架材料。Xu等[48]開(kāi)發(fā)了一種透明質(zhì)酸雙分子層水凝膠體系來(lái)培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞。在此雙層水凝膠結(jié)構(gòu)中的頂層含有肝素修飾的基于透明質(zhì)酸的水凝膠顆粒，并能夠以一定的速率持續(xù)釋放肝素結(jié)合的表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子，而嵌入底層的則是可以從頂部接收生長(zhǎng)因子信號(hào)的前列腺癌細(xì)胞。他們認(rèn)為，與二維培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在此系統(tǒng)中培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上顯著增加了兩種促血管生成因子的表達(dá)，即血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-165(vascular endothelial growth factor-165，VEGF165)和白介素-8(interleukin-8，IL-8)。

2.2 合成支架

2.2.1 聚乳酸(poly lactic acid，PLA)

Polonio等[49]為了建立一種能夠使乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)富集的PLA支架，利用熔絲制造(fused filament fabrication，F(xiàn)FF)3D打印機(jī)制作出不同架構(gòu)的PLA支架并用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)其評(píng)估。他們認(rèn)為，PLA多孔支架用于體外三維培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞可以增加BCSCs的數(shù)量。

2.2.2 聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA)

Jabbari等[50]將乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7和MDA231)、結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116)、胃癌細(xì)胞系(AGS)以及骨肉瘤細(xì)胞系(U2OS)包埋在壓縮模量為2～70 kPa的PEGDA水凝膠中，探究在不受微環(huán)境中其他因素干擾的情況下，癌細(xì)胞組織來(lái)源對(duì)PEGDA酯水凝膠中CSCs生長(zhǎng)及標(biāo)記物表達(dá)的最佳基質(zhì)剛度的影響。他們發(fā)現(xiàn)， CSCs亞群的生長(zhǎng)和標(biāo)記物表達(dá)的最佳基質(zhì)剛度對(duì)于MCF-7和MDA231為5 kPa，對(duì)于HCT116和AGS為25 kPa，而對(duì)于U2OS則為50 kPa。

2.2.3 納米粘土聚合物

Molla等[51]利用基于納米粘土聚合物所構(gòu)建的體外腫瘤培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬了前列腺癌在仿生骨支架上完成骨轉(zhuǎn)移定植的早期階段。他們首先將人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)接種在仿生骨支架上，隨后它們將分化為成骨細(xì)胞，形成礦化骨基質(zhì)而不含成骨補(bǔ)充劑。 最后，將前列腺癌細(xì)胞接種在種有MSCs的支架上。這種“順序培養(yǎng)”使兩種細(xì)胞自發(fā)的形成腫瘤細(xì)胞球體，并具有明顯的緊密細(xì)胞連接及缺氧核心區(qū)域。

3 結(jié) 論

本文總結(jié)了建立腫瘤相關(guān)體外三維培養(yǎng)模型所用的各種方法和材料，及其在乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤等不同類(lèi)型腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展。無(wú)支架體外三維培養(yǎng)技術(shù)主要包括液體覆蓋法及懸滴法；基于支架的體外三維培養(yǎng)技術(shù)主要包括天然支架(藻酸鹽、基質(zhì)膠、膠原、絲素蛋白、透明質(zhì)酸等)及合成支架(PLA、PEGDA酯、納米粘土聚合物等)。此外，體外三維腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型可以模擬真實(shí)的腫瘤微環(huán)境并允許細(xì)胞—細(xì)胞及細(xì)胞—基質(zhì)間相互作用，在研究腫瘤發(fā)病機(jī)理，增殖，遷移和抗藥性方面優(yōu)于傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)。然而，如何建立具有高度再現(xiàn)性及高兼容性的體外三維培養(yǎng)模型仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。