張艷艷，柴麗娜

心肌缺血再灌注損傷是指心肌組織在長時(shí)間缺血后再恢復(fù)血液的灌流，但會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的心肌損傷和功能失常，主要現(xiàn)象為冠狀動(dòng)脈血流量減少和血管反應(yīng)性改變等[1]。近年來，高血壓、高脂血癥等疾病的發(fā)病率逐年提高，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病以及引發(fā)的急性心肌梗死發(fā)病率也隨之增加，嚴(yán)重威脅人類的身心健康[2]。急性心肌梗死在心血管疾病中為高發(fā)病率和高死亡率的疾病之一，因此，心肌缺血再灌注損傷的關(guān)注度也逐年增加[3]。但心肌缺血再灌注損傷的病理機(jī)制極其繁雜，目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)心功能異常、炎癥反應(yīng)和血管新生等是其病程發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病理機(jī)制。

炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的主要發(fā)病機(jī)制[4]。有關(guān)研究表明，急性心肌梗死會(huì)活化補(bǔ)體和產(chǎn)生自由基，引發(fā)梗死的心肌釋放炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[5]。TNF-α繼而刺激白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等其他促炎細(xì)胞因子。有研究表明促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α是心肌功能障礙的關(guān)鍵損害因子。IL-6和TNF-α將進(jìn)一步激發(fā)炎癥細(xì)胞黏附、浸潤到心肌，繼而阻塞毛細(xì)血管、血管活性物質(zhì)和釋放細(xì)胞毒性成分[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷后再灌注過程中炎癥反應(yīng)處于升高水平，而阻斷炎癥反應(yīng)將有利于心肌缺血再灌注病人的恢復(fù)[7]。血管新生可促進(jìn)相應(yīng)缺血組織周圍側(cè)支循環(huán)的建立，改善心肌缺血和壞死等，恢復(fù)心肌血流量，從而改善心肌缺血再灌注病人的療效和預(yù)后情況[8]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)為促血管生成因子，在血管新生的過程中起重要作用。有研究表明，在心肌缺血再灌注病人中，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低[9]。

目前，心肌缺血再灌注的主要治療方式是溶栓和急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療，均是心肌治療最實(shí)用和最廣泛的措施，但是療效均不盡如人意。銀杏內(nèi)酯B是一種從銀杏葉中提取的活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、促血管新生等生物學(xué)作用[10]。有研究表明，銀杏內(nèi)酯B能保護(hù)和改善缺血模型損傷的腦細(xì)胞，緩解心臟毒性。因此，銀杏內(nèi)酯B具有改善心肌缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)作用[11]。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型并采用銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行預(yù)處理，觀察其對(duì)大鼠心肌梗死面積，血清TNF-α、IL-6水平，VEGF蛋白表達(dá)水平以及認(rèn)知功能的影響，以期為銀杏內(nèi)酯B提供臨床用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 隨機(jī)選取雄性健康Wistar大鼠80只，體重200～250 g，分為假手術(shù)組、模型組、銀杏內(nèi)酯B低劑量組(低劑量組)、銀杏內(nèi)酯B高劑量組(高劑量組)，每組20只。低劑量組、高劑量組大鼠分別在造模前灌胃銀杏內(nèi)酯B 15 mg/kg、60 mg/kg，連續(xù)灌胃7 d，其他組大鼠灌胃同體積生理鹽水。參照相關(guān)文獻(xiàn)，采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備心肌缺血再灌注損傷模型[12]。戊巴比妥麻醉大鼠后，連接呼吸機(jī)和心電圖機(jī)，暴露心臟，剪開心包膜，于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部結(jié)扎，心肌顏色由紅變灰白，形成心肌缺血。心電圖為ST段抬高持續(xù)30 min后松結(jié)扎線，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流，心肌變?yōu)榧t色，ST段回落，形成缺血再灌注。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.2 避暗實(shí)驗(yàn) 采用避暗實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的認(rèn)知功能[13]。造模24 h后進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)性訓(xùn)練，依次將大鼠頭朝外放入避暗箱的明室(無電擊)，按照大鼠的趨暗習(xí)性則會(huì)進(jìn)入到暗室，但是進(jìn)入到暗室的大鼠會(huì)受到0.5 mA、5 s的電擊，多次電擊后大鼠會(huì)產(chǎn)生記憶不進(jìn)入到暗室，訓(xùn)練期記錄大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期(Retention-1)。次日進(jìn)行測(cè)試，依次觀察和記錄各大鼠進(jìn)入暗室前的潛伏期(Retention-2，從大鼠放入明室到第1次進(jìn)入到暗室并電擊的時(shí)間)和5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)。行為學(xué)測(cè)試結(jié)束24 h后處死動(dòng)物。

1.3 氮藍(lán)四唑染色法測(cè)定心肌梗死面積 行為學(xué)測(cè)試后，麻醉大鼠取出心臟，將大鼠心室平行切成厚度相等的5片，再加入0.1%氮藍(lán)四唑溶液中，37 ℃烘箱內(nèi)染色15 min。染色后進(jìn)行圖像采集，灰白色為梗死心肌，藍(lán)色為正常心肌。心肌梗死面積(%) = 梗死區(qū)面積/心室總面積×100%[14]。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定炎性因子TNF-α和IL-6水平 取出備用的心肌組織解凍，吸干多余水分和雜質(zhì)后，稱取重量；研磨后置于EP管中，4 ℃離心勻漿組織樣本，取上清液，再進(jìn)行蛋白定量；根據(jù)試劑盒說明書將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為不同濃度；隨后將樣品依次加入樣品孔中，蓋上封板膜后37 ℃恒溫箱孵育；稀釋洗滌液進(jìn)行洗滌，在各孔中加入酶標(biāo)抗體，密封后進(jìn)行孵育，再次重復(fù)上述洗滌過程；再加入顯色試劑，密封并避光孵育；孵育后再滴加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，最后計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)曲線及各指標(biāo)含量[15]。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)測(cè)定VEGF蛋白表達(dá)水平 取大鼠腦組織備用，去掉多余組織殘?jiān)脱?，依次稱重后按照說明書進(jìn)行蛋白定量計(jì)算上樣量。根據(jù)目的蛋白的分子量配制分離膠，用37 ℃烘箱孵育，冷卻后加入濃縮膠插入齒梳，然后按照定量計(jì)算的上樣量進(jìn)行上樣并電泳，再根據(jù)切膠轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后室溫孵育一抗。次日進(jìn)行洗滌，再室溫孵育二抗2 h，同上述洗滌后顯影成像，再進(jìn)行灰度值掃描[16]。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌梗死面積明顯增加(P<0.01)，經(jīng)不同劑量銀杏內(nèi)酯B治療后，低劑量組、高劑量組心肌梗死面積較模型組明顯縮小(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組縮小更明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s) 單位：%

2.2 各組炎性因子TNF-α、IL-6水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織炎性因子TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)不同劑量銀杏內(nèi)酯B治療后，低劑量組、高劑量組心肌組織TNF-α和IL-6水平較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組降低更明顯。詳見表2。

表2 各組炎性因子TNF-α、IL-6水平比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌組織VEGF蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，經(jīng)不同劑量銀杏內(nèi)酯B治療后，低劑量組、高劑量組VEGF蛋白表達(dá)水平較模型組明顯升高(P<0.05)，且高劑量組升高明顯。詳見圖1。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為低劑量組；D為高劑量組。與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.4 各組大鼠的認(rèn)知功能比較 訓(xùn)練期各組大鼠Retention-1比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前各大鼠的基本狀態(tài)無區(qū)別。次日的測(cè)試期，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠進(jìn)入暗室前的潛伏期Retention-2明顯降低(P<0.01)，5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.01)；經(jīng)不同劑量銀杏內(nèi)酯B治療后，低劑量組、高劑量組Retention-2較模型組明顯延長(P<0.05)，5 min內(nèi)進(jìn)入暗室的錯(cuò)誤次數(shù)較模型組明顯減少(P<0.05)。詳見圖2～圖4。

圖2 各組大鼠Retention-1比較

與假手術(shù)組比較，* P<0.01；與模型組比較，# P<0.05。

與假手術(shù)組比較，* P<0.01；與模型組比較，# P<0.05。

3 討 論

心肌缺血后再灌注損傷指冠狀動(dòng)脈部分或者是完全急性梗阻之后，在一定時(shí)間內(nèi)又重新獲得再通的過程，雖然缺血的心肌能再恢復(fù)正常的灌注，但心肌組織損傷進(jìn)一步加重[17]。腦血管疾病仍然是全球人群致殘和死亡的第三大原因，且發(fā)病率逐年增加[18-19]。心肌缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響病人的臨床治療效果和預(yù)后情況，而且發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，比如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管新生等，多種發(fā)病機(jī)制互相聯(lián)系和影響，最終造成心肌功能障礙和認(rèn)知功能障礙[20]。

炎癥細(xì)胞的聚集和炎性因子的釋放為心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵步驟。在炎癥反應(yīng)中，許多細(xì)胞因子得以釋放，如TNF-α、IL-6等促炎因子，而TNF-α是激發(fā)心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)其他促炎細(xì)胞因子IL-6等的釋放，也可誘發(fā)細(xì)胞黏附分子，導(dǎo)致急性心肌組織損傷[21]。另外，TNF-α也參與血管重構(gòu)、阻礙心肌收縮，損害心肌功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，模型組心肌梗死面積和炎性因子TNF-α、IL-6水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。血管新生是指從已存在的血管網(wǎng)中新生長出來的過程。VEGF是一種特異性的肝素結(jié)合生長因子，也是血管新生的關(guān)鍵因子，主要生物學(xué)作用為誘導(dǎo)血管新生。有研究表明，VEGF在體內(nèi)可增加內(nèi)皮的通透性，誘導(dǎo)血管的生成，也是一種重要的血管生成活性物質(zhì)[22]。在缺血性腦血管相關(guān)疾病的血管新生治療和預(yù)后中，VEGF發(fā)揮重要作用[23]。有研究表明，VEGF能修復(fù)和改善缺血再灌注損傷后的血管新生和腦神經(jīng)保護(hù)[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組VEGF蛋白表達(dá)水平和認(rèn)知功能明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。

銀杏內(nèi)酯是中藥銀杏葉中的關(guān)鍵活性物質(zhì)之一，主要包括銀杏內(nèi)酯A、B、C、M和白果內(nèi)酯，均是血小板活化因子受體拮抗劑，具有抗氧化、抗炎、抗過敏、促血管新生、促學(xué)習(xí)記憶等多種生物學(xué)作用[25]。大量研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B可清除缺血再灌注損傷中的自由基，降低微血管張力，縮小梗死面積[26-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注大鼠經(jīng)低、高劑量銀杏內(nèi)酯B治療后，心肌梗死面積和TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，認(rèn)知功能障礙明顯改善(P<0.05)，但是高劑量銀杏內(nèi)酯B療效更好。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B可明顯改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積和認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與降低炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管新生有關(guān)，這可能是銀杏內(nèi)酯B治療心肌缺血再灌注損傷疾病的重要分子機(jī)制之一，但是高劑量銀杏內(nèi)酯B療效更明顯。