何偉強(qiáng) 劉慈斌 何偉源

（1 廣東鼎銘藥業(yè)有限公司 廣東 汕頭 515000）

（2 汕頭市中心醫(yī)院 廣東 汕頭 515000）

陳皮又稱為橘柚，是蕓香科植物橘的干燥果皮，主要成分為黃酮和揮發(fā)油。2010 年藥典認(rèn)為橙皮苷是陳皮的重要成分，近年來發(fā)現(xiàn)川陳皮素和橘皮素是陳皮含量較高的多甲基黃酮類物質(zhì)（PMFs）[1]。廣陳皮是茶枝柑的干燥果皮，主要產(chǎn)自于廣東省新會(huì)地區(qū)，具有較高的食用和藥用價(jià)值，是廣東三寶之首、廣東十大中藥材之一[2]。廣陳皮具有清除自由基、抗氧化、祛痰、促進(jìn)腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)消化等作用，臨床上用于治療功能性消化不良等疾病[3]。PMFs 是甲氧基≥4 的黃酮類化合物。PMFs 抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗腫瘤活性、抗動(dòng)脈粥樣硬化[4]。本研究采用高速逆流色譜法（HSCCC）從廣陳皮中分離多甲基黃酮類物質(zhì)（PMFs）。

1.材料和方法

1.1 儀器和材料

高速逆流色譜儀（TBE-300），高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent-1200），質(zhì)譜儀，超導(dǎo)核磁共振儀，純凈水，分析純?cè)噭┖蜔o水乙醇。廣陳皮，經(jīng)過鑒定為茶枝柑的成熟果皮。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）PMFs 的提取和富集：廣陳皮干燥后過目篩得出粉末1000g，粉末加入2000ml 的燒瓶中，加入1000ml 95%的乙醇，加熱回流1h，重復(fù)3 次后合并3 次提取液得到醇提出物。加入適量水懸浮裝入樹脂層析柱，靜止1h，采用水、75%甲醇和95%甲醇洗脫接收洗脫物，濃縮后得到棕黃色粉末，放入冰箱內(nèi)保存。

（2）容積體系和樣本溶液的選擇：HSCCC 的溶劑為正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水（4:6:4:6）加入漏斗中，充分混勻后靜止得到固定相和流動(dòng)相，超聲洗脫30min 備用。

（3）固定相和流動(dòng)相的選擇：下相為固定相，上相為流動(dòng)相時(shí)分離基線不穩(wěn)定，固定相丟失，因此上相為固定相，下相為流動(dòng)相。

（4）流動(dòng)相體積流量、柱溫和轉(zhuǎn)速的選擇：流動(dòng)相過低導(dǎo)致分離周期延長(zhǎng)，過高導(dǎo)致分離效果較差。柱溫過低導(dǎo)致固定相丟失，柱溫過高導(dǎo)致出現(xiàn)氣泡影響分離。轉(zhuǎn)速越快固定相保留率越高。因此流動(dòng)相體積流量、柱溫和轉(zhuǎn)速分別為2L/min、860r/min35℃。

（5）HSCCC分離制備：固定相20ml/min的速度加入分離管中，充滿管路，轉(zhuǎn)速860r/min，液體相2L/min 注入，柱溫35℃，按照色譜峰接受目標(biāo)的餾分。得到A、B、C、D、E 5 個(gè)成分。

2.結(jié)果分析

2.1 HSCCC 溶劑的選擇

合適的溶劑系統(tǒng)是HSCCC 的關(guān)鍵步驟，根據(jù)分離物的極性和參考文獻(xiàn)，本研究選擇正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水、氯仿：甲醇：水、乙酸乙酯：乙醇、水、氯仿：甲醇、正丁醇、水不同的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分析，樣本的分離系數(shù)k需要在一個(gè)合適的范圍，如果k≤0.5出峰時(shí)間太快，分離變差；如果k≥1出峰時(shí)間太長(zhǎng)，峰形變寬，本研究選擇正乙烷：乙酸乙酯、甲醇：水上機(jī)試驗(yàn)，可分離出5 種PMFs 單體，圖譜的峰形較好。

2.2 HSCCC 檢測(cè)分析

對(duì)5 個(gè)成分進(jìn)行檢測(cè)，面積歸化法測(cè)定A、B、C、D、E 的純度分別為99.5%、98.7%、99.0%、86.3%、83.2%。D、E 純度不足，需要進(jìn)一步純化處理。

2.3 化合物鑒定

化合物A 無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C21H22O8，光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物A 為5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮（川陳皮素）[5]。化合物B 黃色針狀結(jié)晶（乙酸乙酯），分子式為C22H24O9，光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物B 為3,5,6,7,8,3’,4’—七甲氧基黃酮?；衔餆o色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C20H20O7，光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故化合物C 為5,6,7,8,4’-五甲氧基黃酮（橘皮素）。

3.討論

HSCCC 起源于20 世紀(jì)80 年代新型液液分離系統(tǒng)，固定相和液體相均為液體，利用溶質(zhì)在互不相溶的溶液中分散系數(shù)不同進(jìn)行分離，由于不需要固體介質(zhì)避免固體填塞造成樣本丟失，全部回收樣品，分離量大，快速高效。分離柱容積大，無填料，柱內(nèi)空間均為有效空間，制備量從毫克到克量級(jí)；溶劑用量少，成本低；適用于分離純化。

應(yīng)用HSCCC 分離天然產(chǎn)物需要選擇良好的容積，控制上下兩層在30s 內(nèi)乳化，k值盡量控制在0.5 ～1 確定最佳的熔劑系統(tǒng)，此外選擇合適的流動(dòng)相體積流量、柱溫和轉(zhuǎn)速亦十分重要。

綜上所述，采用HSCCC 分離得到純度高的化合物，簡(jiǎn)便可行，不僅可以作為廣陳皮質(zhì)量控制的參考物質(zhì)，而且為柑橘類植物分類提供科學(xué)的依據(jù)。