李躋

（寧夏永寧縣閩寧鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心銀川 750104）

關(guān)鍵字：PCR 技術(shù)；診斷；家畜血吸蟲病；應(yīng)用與推廣

以間接血凝試驗(yàn)（IHA）為代表的血清學(xué)診斷技術(shù)逐步在我國家畜血吸蟲病診斷中發(fā)揮越來越重要的作用，但其始終作為一種初篩的工具，不能作為確診的依據(jù)。以糞便毛蚴孵化為代表的病原學(xué)診斷技術(shù)是家畜血吸蟲病確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但隨著流行程度和感染強(qiáng)度的進(jìn)一步降低，其敏感性飽受詬病。檢測(cè)核酸物質(zhì)的方法為家畜血吸蟲病診斷開辟了新途徑，在特定意義上，核酸檢測(cè)也屬于病原學(xué)檢測(cè)的范疇，可作為家畜血吸蟲病確診的依據(jù)。另外，多項(xiàng)研究證實(shí)，核酸檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性。核酸檢測(cè)一般基于PCR 技術(shù)建立，2002 年，糞便PCR 診斷技術(shù)首先應(yīng)用于檢測(cè)曼氏血吸蟲感染，其后，PCR 診斷技術(shù)應(yīng)用不斷增多，并相繼出現(xiàn)診斷日本血吸蟲和埃及血吸蟲病的報(bào)道[1]。下面就將基于PCR 及其延伸技術(shù)在家畜血吸蟲病診斷上的應(yīng)用介紹如下：

1 血吸蟲核酸檢測(cè)的可行性

只要病原體存在于家畜或受體體內(nèi)，機(jī)體內(nèi)就會(huì)有其核酸物質(zhì)的存在，日本血吸蟲生活史和寄生部位的特殊性決定了核酸檢測(cè)技術(shù)的可行性。日本血吸蟲尾蚴侵入家畜皮膚后轉(zhuǎn)變?yōu)橥x，此后血吸蟲就在家畜的循環(huán)系統(tǒng)中移行、發(fā)育、成熟和產(chǎn)卵。在上述的過程中，血吸蟲的體被和表膜發(fā)生更新、脫落，包括細(xì)胞在宿主血液中發(fā)生崩解，其核酸物質(zhì)就持續(xù)出現(xiàn)在宿主血液中，有關(guān)日本血吸蟲核酸在宿主體內(nèi)的代謝研究顯示，核酸在進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，首先分布在血清中，隨后隨血液進(jìn)入肝臟[2]。PCR 可將微量的靶DNA 特異性地?cái)U(kuò)增，從而提高了對(duì)DNA 分子的分析和檢測(cè)的可能性，也相應(yīng)的提高了檢測(cè)的敏感性。目前，從常規(guī)PCR 到巢式PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、LAMP 等技術(shù)均有在家畜血吸蟲病診斷的報(bào)道。

2 現(xiàn)有的核酸分子靶標(biāo)

診斷靶標(biāo)的選擇是目前分子生物學(xué)診斷技術(shù)核心問題，從本質(zhì)而言對(duì)樣本核酸的檢測(cè)即為對(duì)靶標(biāo)分子的檢測(cè)。下為主要研究的靶標(biāo)基因或分子。

2.1 核糖體18S rRNA 基因序列

18S rRNA 基因序列長度為1883bp，為血吸蟲看家基因，拷貝數(shù)較多，以其為靶標(biāo)序列先后在日本血吸蟲不同發(fā)育階段的動(dòng)物宿主的多種樣本中檢測(cè)到了特異性片段?；谠摶蚪⑵鹆顺Ｒ?guī)PCR、熒光定量PCR 技術(shù)，檢測(cè)限可達(dá)10fg，并且在感染的早期即可檢測(cè)到該靶標(biāo)，提示18S rRNA 靶序列的診斷價(jià)值。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjR2

SjR2 具有高度保守和多拷貝的特點(diǎn)，長3,921bp，在基因組中約有400 個(gè)完整拷貝和23,755 個(gè)不完全拷貝，分散在整個(gè)染色體中，并可在血吸蟲生活史多個(gè)階段及動(dòng)物宿主糞便和血清中檢測(cè)到?；诖税谢蚪⑵鸪Ｒ?guī)PCR、熒光定量PCR 及LAMP 法，其敏感性可達(dá)到80fg/μL 和0.08fg/μL，并且可在感染早期擴(kuò)增出特異性條帶，并于治療后一段時(shí)間轉(zhuǎn)陰，除具有診斷價(jià)值外還具備療效考核價(jià)值。

2.3 線粒體基因

線粒體基因?yàn)榛蛞黄蔚目偡Q，因線粒體在日本血吸蟲病進(jìn)化史上較為保守，基因變異程度較小，有可能具有特異性診斷日本血吸蟲病的價(jià)值，尤其用于區(qū)別其他物種。目前，常用的線粒體基因有COX1、NADH1 等，以其作為靶標(biāo)建立的相應(yīng)PCR 技術(shù)檢測(cè)限也可達(dá)到pg 級(jí)別。由于線粒體基因相對(duì)保守，其在鑒別診斷與日本血吸蟲親緣關(guān)系較近的蟲種時(shí)可能存在一定的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致診斷的特異性降低。

2.4 5D 基因

編碼日本血吸蟲毛蚴抗原的5D 基因是最早應(yīng)用于日本血吸蟲核酸診斷的靶基因。該基因?yàn)槿毡狙x基因組中一重復(fù)序列，大小為560bp，以其為目的基因建立的的檢測(cè)技術(shù)除具備良好的敏感性外，其特異性較高也是該基因的一大優(yōu)勢(shì)。

3 核酸分子檢測(cè)技術(shù)

PCR 技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)中發(fā)展最快，普及最為迅速，應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，目前在經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)的地區(qū)，縣級(jí)動(dòng)物疫病控制部門幾乎都配有PCR 儀。PCR 技術(shù)是體外酶促合成特異DNA 的方法，使少量甚至痕量目的基因在體外快速擴(kuò)增達(dá)到檢測(cè)級(jí)的方法。目前，除用于家畜血吸蟲病診斷外，其已經(jīng)在越來越多的動(dòng)物疫病的診斷、檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用，并且在標(biāo)準(zhǔn)PCR 的基礎(chǔ)上，衍生出多種PCR 方法。除常規(guī)PCR 外，常見的還有巢式PCR、熒光定量PCR 和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LAMP）[3]。這些方法的發(fā)展使動(dòng)物血吸蟲病的診斷向高敏感、高精度的方向發(fā)展。尤其LAMP 技術(shù)，其擺脫了PCR技術(shù)對(duì)于儀器依賴，可用肉眼直接進(jìn)行結(jié)果的觀察。

4 核酸樣品制備及處理方法

在家畜血吸蟲病分子生物學(xué)診斷中最常用的樣本為血樣和糞樣。糞樣DNA 作為模板的PCR 檢測(cè)方法最早可在感染后3 周出現(xiàn)陽性反應(yīng)，血樣則可在感染1～2 周后就可有陽性反應(yīng)，提示分子生物學(xué)診斷技術(shù)可具有早期診斷的價(jià)值。傳統(tǒng)提取糞樣DNA 使用ROSE 法，血樣采取堿裂解法，目的為除去DNA 中的PCR 反應(yīng)抑制物。現(xiàn)今由于商品化的試劑盒的發(fā)展，DNA 提取更加快捷方便，加速了分子生物學(xué)技術(shù)在基層的應(yīng)用。

5 討論

高特異性和敏感性是核酸分子技術(shù)得到迅速發(fā)展的重要因素，其中特異性是評(píng)價(jià)一種檢測(cè)技術(shù)的最重要的指標(biāo)之一。血吸蟲具有許多特異的基因序列，檢測(cè)其特異性基因片段與檢獲蟲體具有同樣的診斷價(jià)值。分子生物學(xué)技術(shù)直接針對(duì)血吸蟲的DNA 片段，理論上具有高度的特異性，比血清學(xué)方法更加可靠、穩(wěn)定。此外，分子生物學(xué)檢測(cè)具有早期診斷價(jià)值，可在感染的較早期采取相應(yīng)的措施包括藥物治療，即可減少料肉轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)損失，又可避免大型家畜產(chǎn)生含蟲卵的糞便持續(xù)維持血吸蟲生活史，造成連續(xù)的傳播。PCR 產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加，能將微量甚至痕量級(jí)的待測(cè)產(chǎn)物擴(kuò)增到微克的可檢測(cè)級(jí)別，這種擴(kuò)大方式為該類方法的敏感性提供了基礎(chǔ)，但同樣又面臨的敏感性過高帶來的假陽性問題。此外污染也是核酸檢測(cè)產(chǎn)生假陽性的重要原因，在實(shí)際的操作中，多數(shù)的假陽性的出現(xiàn)源于污染原因。目前，雖然基層很多疫控和畜牧獸醫(yī)部門具備PCR 檢測(cè)的儀器設(shè)備，處理大量的現(xiàn)場(chǎng)樣本及隨后的上機(jī)檢測(cè)需要消耗較長時(shí)間，分子生物學(xué)試劑費(fèi)用相對(duì)較高等缺點(diǎn)給分子生物學(xué)方法在基層的推廣帶來一定的難度，但分子生物學(xué)檢測(cè)方法是未來發(fā)展方向，尤其是家畜血吸蟲病流行程度較低后對(duì)精準(zhǔn)檢測(cè)具有更多的需求。

6 小結(jié)

近年來，除在小鼠和兔血吸蟲感染分子生物學(xué)檢測(cè)外，牛羊血吸蟲病的PCR 檢測(cè)的報(bào)道逐漸增多，因此早日開發(fā)出穩(wěn)定、高效的適用于牛羊等動(dòng)物的血吸蟲病核酸分子檢測(cè)方法必將提高動(dòng)物血吸蟲病的診斷水平，從而為動(dòng)物血吸蟲病的防治和流行病學(xué)提供新的方法。