朱 衡，張繼福，張 云，胡云峰*

(1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301； 2. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南海海洋研究所)，廣東 廣州 510301；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣東 廣州 511458； 4. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 5. 廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120)

目前最適合的解決辦法就是將脂肪酶固定化，使用的固定化方法包括包埋法[16]、吸附法、共價結(jié)合法和交聯(lián)法等[17]。另外，聯(lián)合固定化方法也在研究中表現(xiàn)優(yōu)異。如：錢明華等[18]用大孔樹脂 HPD750為載體，以聚乙二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑，得到的固定化酶使用10次，仍保留34.86%的酶活，4 ℃保存30 d后保留64.81%酶活；林海蛟等[19]利用硅藻土和乙二醇縮水甘油醚進(jìn)行吸附-交聯(lián)固定化海洋脂肪酶，連續(xù)操作5次后依然保留47%的酶活性；徐珊[20]利用包埋-交聯(lián)法固定化海洋脂肪酶，在重復(fù)使用7次后保持60%左右酶活；楊秀芳等[21]利用殼聚糖為載體，采用包埋-交聯(lián)法固定β-呋喃果糖苷酶，得到酶活較好的固定化酶。目前，帶有氨基、羧基、羥基等修飾基團(tuán)的合成樹脂在固定化酶制備中表現(xiàn)優(yōu)異。如：徐珊等[22]利用國產(chǎn)環(huán)氧樹脂LXEP-120固定化豬胰脂肪酶，優(yōu)化后的固定化酶使用10次仍保留70%的酶活；朱衡等[23]使用氨基載體結(jié)合雙功能試劑戊二醛固定化海洋脂肪酶，得到的固定化酶最適反應(yīng)溫度較游離酶提高了10 ℃，使用6次后保留40%酶活。

共價結(jié)合法聯(lián)合交聯(lián)法[24]所獲得的固定化酶具有穩(wěn)定性高、不易脫落和機(jī)械強(qiáng)度大等優(yōu)勢，相比于包埋法和吸附法，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中更具工業(yè)價值。與戊二醛和環(huán)氧試劑等交聯(lián)劑不同，碳二亞胺EDC (C8H17N3，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)本身作為一種蛋白質(zhì)和核酸的交聯(lián)劑，可實(shí)現(xiàn)快速的多肽縮合反應(yīng)，EDC分子呈現(xiàn)線性結(jié)構(gòu)，可用于羧基和伯胺的縮合反應(yīng)。羧基載體LX-1000IDA是一種羧基功能化的無機(jī)載體，具有高孔容和比表面積，而且載酶量大、固定化酶活性高、顆粒均勻和機(jī)械強(qiáng)度高。本文使用交聯(lián)劑EDC和羧基載體進(jìn)行海洋脂肪酶的固定化研究，反應(yīng)過程如圖1。為優(yōu)化固定化條件，利用單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett Burman試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳固定化條件?？紤]到實(shí)際制備環(huán)境和條件，進(jìn)行了模擬擴(kuò)大固定化實(shí)驗(yàn)。對制備的固定化酶酶學(xué)性質(zhì)鑒定表明，本文所制備的固定化酶表現(xiàn)優(yōu)異。

圖1 固定化脂肪酶IDA-LIPASE制備原理示意Fig. 1 Preparation principle of immobilization of lipase IDA-LIPASE

1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

LX-1000IDA購于西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司；EDC (C8H17N3，CAS：25952-53-8)購于上海麥克林試劑公司；海洋假絲酵母脂肪酶(CAS: 9001-62-1)購于上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購于Generay Biotech。

橄欖油購于上海麥克林試劑公司；聚乙烯醇購于天津大茂化學(xué)試劑廠，利用實(shí)驗(yàn)用水配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的聚乙烯醇溶液，聚乙烯醇-橄欖油(體積比3∶1)，混合后超聲，超聲功率40%，開2 s，關(guān)1 s，超聲5 min，搖勻后再次超聲5 min，4 ℃冰箱備用；濃鹽酸購于廣東白云區(qū)良田光明化工廠；無水乙醇購于廣東光華科技股份有限公司；異辛烷購于天津大茂化學(xué)試劑廠；無水醋酸銅、吡啶購于上海麥克林試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

發(fā)酵搖床(上海實(shí)維儀器)；高速離心機(jī)(Beckman)；酶標(biāo)儀(Tecan)；超聲破碎儀(新芝生物科技)；低溫冰箱(中科美菱)；電熱烘箱(一恒科學(xué)儀器)；恒溫水浴鍋(一恒科學(xué)儀器)；渦旋振蕩儀(Tomos)；pH計(Sartorius)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪酸濃度測定

以油酸為標(biāo)準(zhǔn)物，配制不同濃度的油酸溶液，用醋酸銅顯色，測定銅皂的吸光度，以吸光度對油酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=0.006 2x-0.005 5，R2=0.999 8。

1.3.2 酶活性測定

以乳化橄欖油為底物反應(yīng)15 min，加入無水乙醇和鹽酸終止酶反應(yīng)，并使底物乳液破乳，用異辛烷萃取生成的脂肪酸，并用醋酸銅顯色，通過測定銅皂的吸光度得到生成脂肪酸的量，計算出脂肪酶的活力。

酶活力定義：一定條件下，在1 min內(nèi)催化底物生成1 μmol脂肪酸所需要的酶量。

游離酶溶液的酶活力計算公式為

U游=cV異/(Vt)，

式中：c為脂肪酸的濃度，mmol/L；V異為異辛烷萃取溶液的體積，mL；V為酶液的用量，mL；t為反應(yīng)時間，min。

固定化酶的酶活力計算公式為

U固=cV異/(mt)，

式中：c為脂肪酸的濃度，mmol/L；V異為異辛烷萃取溶液的體積，mL；m為固定化酶的用量，g；t為反應(yīng)時間，min。

1.3.3 脂肪酶的固定化

預(yù)處理載體LX-1000IDA：取適量載體置于培養(yǎng)皿中的濾紙上，30 ℃烘箱過夜干燥。

固定化：取潔凈干燥的50 mL離心管，精確稱取所需載體LX-1000IDA，加入10 mL所需濃度的交聯(lián)劑，再加入10 mL配置好的游離酶液，于適當(dāng)溫度下，進(jìn)行一定時間的振蕩，保證充分反應(yīng)。抽濾除去未結(jié)合的游離酶及交聯(lián)劑，30 ℃烘干待測酶活。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 載體、酶液和交聯(lián)劑的添加順序?qū)潭ɑ傅幕钚杂绊?/p>

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.5 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，pH為7.0，考察載體、酶液和交聯(lián)劑的添加順序?qū)潭ɑ傅幕钚杂绊?見表1)，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

表1 載體、酶液和交聯(lián)劑添加順序方案設(shè)計

1.3.4.2 緩沖液濃度對固定化酶的活性影響

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.5 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，pH為7.0，考察緩沖液離子濃度(0.05、0.1、0.2 mol/L，pH7.0)對固定化酶的活性影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.4.3 pH對固定化酶的活性影響

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.5 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，考察不同pH環(huán)境(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)對固定化酶活性的影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.4.4 EDC濃度對固定化酶的活性影響

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.5 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，pH為4.5，考察EDC終質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)對固定化酶的活性影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.4.5 溫度對固定化酶的活性影響

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.5 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，pH為4.5，考察溫度(20、25、30、35、40 ℃)對固定化酶的活性影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.4.6 載體量對固定化酶的活性影響

設(shè)定游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，pH為4.5，考察載體量(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g)對固定化酶的活性影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.4.7 固定化時間對固定化酶的活性影響

設(shè)定LX-1000IDA載體量為0.4 g，游離酶液為10 mL(質(zhì)量濃度為2 g/L)，交聯(lián)劑EDC為10 mL(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%)，固定化時間為6 h，固定化溫度為25 ℃，pH為4.5，考察固定化時間(2、4、6、8、10 h)對固定化酶的活性影響，重復(fù)3次確定最終結(jié)果。

1.3.5 Plackett Burman試驗(yàn)篩選對酶活影響較為顯著因素

通過PB試驗(yàn)篩選固定化實(shí)驗(yàn)的主要影響因素，針對pH、EDC濃度、溫度、載體量、時間5個因素，利用Design expert軟件進(jìn)行Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)因素水平如表2。

表2 Plackett Burman試驗(yàn)因素水平

將得到的絕對酶活數(shù)據(jù)利用Design expert軟件進(jìn)行方差分析，篩選出對酶活影響較為顯著的3個因素。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳固定化條件

將PB試驗(yàn)篩選出的對酶活影響較為顯著的3個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，其余因素皆用單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳條件，正交試驗(yàn)設(shè)計方案如表3。

表3 正交試驗(yàn)因素水平

將得到的絕對酶活數(shù)據(jù)利用Minitab 17進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終確定最佳固定化條件。

1.3.7 最佳條件固定化擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett Burman試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到的最佳固定化條件，對實(shí)際固定化酶制備進(jìn)行10倍放大模擬試驗(yàn)。

1.3.8 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

1.3.8.1 最適反應(yīng)pH

按照最適固定化條件制備的固定化酶和游離酶，在40 ℃反應(yīng)溫度下，在pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的緩沖液環(huán)境中進(jìn)行酶活測定，重復(fù)3次并進(jìn)行比較。

1.3.8.2 最適反應(yīng)溫度

按照最適固定化條件制備的固定化酶和游離酶，在1.3.8.1小節(jié)確定出的最適反應(yīng)pH下，在不同溫度(25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)環(huán)境中進(jìn)行酶活測定，重復(fù)3次并進(jìn)行比較。

1.3.8.3 熱穩(wěn)定性

按照最適固定化條件制備的固定化酶和游離酶，①采用不同溫度(40、50、60、70 ℃)水浴環(huán)境中孵育3 h后，在以上確定出的最適反應(yīng)條件下進(jìn)行酶活測定；②分別在70 ℃孵育環(huán)境中孵育3 h，每隔30 min取出一部分測定酶活。利用以上2種方法探究固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的表現(xiàn)，重復(fù)3次并進(jìn)行比較。

1.3.8.4 酸堿耐受性

按照最適固定化條件制備的固定化酶在不同pH (5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)磷酸緩沖液環(huán)境中孵育3 h；游離酶利用不同pH磷酸緩沖液配置酶液，靜置3 h。兩者均在以上確定出的最適反應(yīng)條件下進(jìn)行酶活測定；重復(fù)3次并進(jìn)行比較。

1.3.8.5 操作穩(wěn)定性

按照最適固定化條件制備的固定化酶在相同的底物環(huán)境中重復(fù)進(jìn)行催化底物水解反應(yīng)，以第1次的酶活為100%，重復(fù)使用7次觀察固定化酶重復(fù)使用性。

1.3.8.6 儲存穩(wěn)定性

按照最適固定化條件制備的固定化酶分裝成0.1 g 1.5 mL EP管，與pH7.0的游離酶同時在4 ℃冰箱中保存一個月，每隔5 d于9：00測定當(dāng)天的酶活，并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 載體、酶液和交聯(lián)劑的添加順序?qū)潭ɑ傅幕钚杂绊?/p>

載體、酶液和交聯(lián)劑的添加順序?qū)潭ɑ傅幕钚杂绊懸妶D2(a)。由圖2(a)可知：方案4制備的固定化酶的活性最高，即載體、酶液和EDC一起添加，進(jìn)行振蕩固定化得到的固定化酶活性最好。這是由于將3者同時混合加入，接觸反應(yīng)的概率更高，交聯(lián)固定化的效果最佳，而分批次加入酶液和EDC試劑會存在交聯(lián)不徹底或者固定化不充分的情況，導(dǎo)致交聯(lián)不牢固，進(jìn)而固定化酶的活性降低。因此利用方案4進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 緩沖液濃度對固定化酶的活性影響

緩沖液濃度對固定化酶的活性影響見圖2(b)。由圖2(b)可知：緩沖液濃度對固定化酶的影響較小，在0.05、0.1、0.2 mol/L緩沖液環(huán)境中進(jìn)行固定化，酶活變化范圍在5%左右。在緩沖液濃度較低時隨著濃度升高，制備的固定化酶的活性也升高，在緩沖液濃度為0.1 mol/L時最高，若繼續(xù)提高緩沖液濃度，制得的固定化酶的酶活反應(yīng)下降。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取0.1 mol/L為最佳緩沖液濃度。

2.1.3 pH對固定化酶的活性影響

pH對固定化酶的活性影響見圖2(c)。由圖2(c)可知：固定化酶的酶活隨pH增大而減小，在pH 4.5時達(dá)到最佳酶活，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將固定化pH設(shè)定為4.5。這可能是因?yàn)榻宦?lián)劑EDC在酸性pH的環(huán)境中活性最好，而在堿性環(huán)境中會影響交聯(lián)過程中表面電荷的分布，干擾交聯(lián)基團(tuán)的反應(yīng)，阻礙反應(yīng)的進(jìn)程，進(jìn)而影響交聯(lián)情況，對固定化酶的活性會有較大影響。

2.1.4 EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的活性影響

EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的活性影響見圖2(d)。由圖2(d)可知：固定化酶的活性隨著交聯(lián)劑EDC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在終質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%達(dá)到最佳的固定化酶活性，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取0.6%為最佳交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這可能是在DEC低于0.6%時，EDC濃度太低不能完全對游離酶進(jìn)行交聯(lián)，但是超過0.6%會導(dǎo)致交聯(lián)劑濃度過高，影響與載體的連接，同時還會導(dǎo)致催化過程中底物與酶的接觸，影響催化效果。

2.1.5 溫度對固定化酶的活性影響

溫度對固定化酶的活性影響見圖2(e)。由圖2(e)可知：固定化酶的活性隨著溫度升高，在25 ℃達(dá)到最佳酶活，在溫度大于25 ℃時，雖然酶活逐漸降低，但是仍比20 ℃的酶活好。這可能是因?yàn)闇囟冗m當(dāng)提高有利于分子熱運(yùn)動，使得分子間擴(kuò)散速率提高，促進(jìn)酶液、載體與交聯(lián)劑間的接觸，進(jìn)而增加固定化的充分性，適當(dāng)?shù)臏囟确秶鼙ＷC脂肪酶的活性，但溫度過高會導(dǎo)致酶失活。為了最佳效果及成本考慮，選取25 ℃為最佳固定化溫度。

2.1.6 載體量對固定化酶的活性影響

載體量對固定化酶的活性影響見圖2(f)。由圖2(f)可知：隨著載體量增大，固定化酶的活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在0.4 g達(dá)到最佳酶活。載體量少于0.4 g時，游離酶不能被充分固定化，可能會使得酶液有剩余，而在大于0.4 g后，隨載體量增加，固定化酶的活性趨于平穩(wěn)，說明添加0.4 g載體是最合適的配比，若大于0.4 g就可能產(chǎn)生一些無效的連接或者交聯(lián)非目的酶，導(dǎo)致活性下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選取0.4 g為最佳載體量。

2.1.7 固定化時間對固定化酶的活性影響

固定化時間對固定化酶的活性影響見圖2(g)。由圖2(g)可知：隨著固定化時間的增加，固定化酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在8 h達(dá)到最佳。這是由于固定化時間過短會導(dǎo)致固定化不完全，固定化效率低。但固定化時間過長，長時間(大于8 h)的振蕩孵育，可能導(dǎo)致一些已經(jīng)固定化的酶脫落，引起酶活的降低。因此固定化時間選取8 h。

(a)載體、酶液和交聯(lián)劑的添加順序

(b)緩沖液濃度

(c)pH

(d)EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)

(e)溫度

(f)載體量

(g)固定化時間

2.2 Plackett Burman試驗(yàn)篩選主要顯著因素

Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果如表4，將得到的絕對酶活數(shù)據(jù)在Design expert軟件進(jìn)行方差數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如表5。由表5可知：該模型參數(shù)合理，信噪比充足可信。pH、載體量、時間3個因素的P值小于0.05，為顯著因素。因此選擇pH、載體、時間為固定化條件中影響顯著的因素，進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)優(yōu)化條件。

表4 Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果

表5 Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳固定化條件

根據(jù)Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)對酶活具有顯著影響的3個因素是：pH、載體量、時間，按照表3進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表6，利用軟件對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表7)，可以得出：pH、載體量、時間確實(shí)是影響顯著的因素，其P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.5，與Plackett Burman試驗(yàn)結(jié)果一致。由均值響應(yīng)表(表8)可以看出，這3個因素的影響排序是：pH>載體量>時間，最佳固定化條件為：pH 4.5、載體量0.2 g、時間6 h。結(jié)合單因素中的最優(yōu)條件溫度25 ℃、EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，可以得到最佳固定化條件為：pH 4.5、 載體量0.2 g、時間6 h、溫度25 ℃、EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%。在此條件下制備的固定化酶的酶活為114 U/g。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

表7 正交試驗(yàn)方差分析

表8 均值響應(yīng)

2.4 最佳固定化條件擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett Burman試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定的最佳固定化條件為：pH 4.5、載體量0.2 g、時間6 h，溫度25 ℃、EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%。在實(shí)驗(yàn)探索階段利用50 mL的離心管一次僅能制備0.2 g固定化酶，為提高效率，在最佳條件的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行放大10倍的擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大固定化后，固定化酶的絕對酶活是未擴(kuò)大前酶活的約2倍(210 U/g)。表明我們的研究完全可以為實(shí)際工業(yè)擴(kuò)大化制備固定化酶。

2.5 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.5.1 最適反應(yīng)pH

由圖3(a)可知，在pH 5.0～8.5內(nèi)，游離酶的最適反應(yīng)pH為7.5，而固定化酶IDA-LIPASE最適反應(yīng)pH為8.0，固定化酶相比于游離酶的最適反應(yīng)pH向堿性方向移動0.5。由兩者變化趨勢也可以發(fā)現(xiàn)，在堿性環(huán)境中，固定化酶表現(xiàn)更佳，可以更好地耐受堿性環(huán)境。這可能是由于固定化連接上了載體和交聯(lián)劑，脂肪酶表面的電荷環(huán)境受到干擾，離子平衡被打破，在堿性環(huán)境可以保持其表面微環(huán)境的平衡，使得結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定；或者堿性環(huán)境使得固定化酶能夠更容易地向活性構(gòu)象轉(zhuǎn)換，從而能更利于酶促反應(yīng)的發(fā)生。

2.5.2 最適反應(yīng)溫度

由圖3(b)可知，固定化酶IDA-LIPASE相比于游離酶，最適反應(yīng)溫度由40 ℃升高為50 ℃，在溫度較高的環(huán)境中能更好地發(fā)揮催化效應(yīng)。這是由于固定化后，載體本身具有較高機(jī)械強(qiáng)度，可以抵擋熱的攻擊，同時，載體、交聯(lián)劑、酶分子形成的大分子，具備更加穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)，在應(yīng)對高強(qiáng)度的熱襲擊和振蕩過程中可以穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)的彈性，因此固定化酶的最適反應(yīng)溫度得到提高，在較熱環(huán)境中會表現(xiàn)出更佳的催化活性潛力，在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中更具有優(yōu)勢。

2.5.3 操作穩(wěn)定性

固定化酶具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的一大優(yōu)勢就是其重復(fù)利用性，相比于游離酶液只能使用一次，固定化酶可以在使用后簡單分離，進(jìn)行重復(fù)使用，由圖3(c)可以看出，固定化酶IDA-LIPASE在重復(fù)使用4次時還有50%的酶活，在重復(fù)使用第7次時還保留40%左右的酶活，表現(xiàn)出較好的操作穩(wěn)定性。

2.5.4 酸堿穩(wěn)定性

由圖3(d)可以看出，在酸性環(huán)境中孵育，固定化酶IDA-LIPASE相比于游離酶沒有較好的表現(xiàn)，但是在堿性環(huán)境中，固定化酶的耐受性得到提高，但是也與游離酶相差不大?？赡苁怯捎陂L時間酸堿環(huán)境的孵育和浸泡對IDA-LIPASE的離子環(huán)境有較大影響，導(dǎo)致連接鍵不穩(wěn)定，因此會有酶活的損失。

2.5.5 熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性通過2種方法進(jìn)行測定，由圖3(e)和(f)可知：①在40、50、60、70 ℃孵育3 h后，固定化酶IDA-LIPASE相比于初始酶活有不同程度的提高，最高提高約25%，而游離酶則隨孵育溫度的提高，以50 ℃為分界，酶活先升高后降低；②在70 ℃的水浴鍋中孵育3 h，每隔0.5 h取出一部分測剩余酶活，發(fā)現(xiàn)固定化酶相比于游離酶，酶活損失更小，游離酶在0.5 h僅剩55%左右的酶活，而固定化酶在3 h后還保留60%的酶活。

由此可以得出：固定化酶IDA-LIPASE相比于游離酶對熱的耐受性是相當(dāng)出色的，游離酶固定化后，酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，能抵抗高溫環(huán)境，在實(shí)際催化反應(yīng)中有較寬的溫度適應(yīng)范圍。

2.5.6 儲存穩(wěn)定性

游離脂肪酶液和固定化脂肪酶IDA-LIPASE保存在4 ℃冰箱30 d，每隔5 d測定其酶活，觀察其隨時間變化的趨勢。由圖3(g)可知：儲存30 d，固定化酶的活性保留率更高，剩余84.6%的酶活，而游離酶僅剩余79%的酶活。

3 討論

碳二亞胺EDC作為蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑，可以將羧基載體與酶蛋白的氨基進(jìn)行化學(xué)結(jié)合固定化。有研究顯示碳二亞胺可以作為固定化酶的交聯(lián)劑，固定胰凝乳蛋白酶[25-26]，其在45 ℃ 孵育4.5 h后，固定化酶的剩余活性高達(dá)92.5%。本文工作也印證了碳二亞胺作為固定化交聯(lián)劑的作用，且固定化效果良好。Zhu Yuanting等[27]利用EDC偶聯(lián)羧基化的磁性納米顆粒固定化豬胰脂肪酶，獲得的脂肪酶在70 ℃中保留60%的初始酶活，其耐熱性低于本文所制備的固定化酶，且制備過程復(fù)雜，磁性納米顆粒的成本更高。Zhu Jun等[28]利用絲瓜絡(luò)固定化脂肪酶，絲瓜絡(luò)海綿通過檸檬酸羧基與纖維素羥基之間的熱化學(xué)酯化反應(yīng)，引入了游離羧基，以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)為縮合試劑，與脂肪酶氨基反應(yīng)進(jìn)行固定化，需要在絲瓜絡(luò)中先引入羧基，因此增加了制備復(fù)雜性和不均一性，其固定化脂肪酶的最高活性為45.8 U/g，所得酶活低于本文所制備的固定化酶。

(a)最適反應(yīng)pH

(b)最適反應(yīng)溫度

(c)操作穩(wěn)定性

(d)酸堿耐受性

(e)在70 ℃下孵育3 h酶活變化

(f)在不同溫度下孵育3 h剩余酶活

(g)儲存穩(wěn)定性

本工作為使用EDC和羧基載體固定化脂肪酶提供了具體的工作流程和參數(shù)支持，所使用的載體、酶粉等均已實(shí)現(xiàn)工業(yè)級制備，該方法也具有實(shí)際應(yīng)用的可能性，所制備的固定化酶IDA-LIPASE在酶學(xué)性質(zhì)測定中表現(xiàn)良好，在模擬擴(kuò)大制備的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)該方法有潛力進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用，可以適應(yīng)固定化酶工業(yè)量產(chǎn)的需求。眾多科研人員將精力投入于實(shí)驗(yàn)室級別制備新型材料，十分具有創(chuàng)新性，但是真正應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)仍需要花費(fèi)很長時間的研究，而且在保證大批量、高質(zhì)量和高均一性的要求下實(shí)現(xiàn)新型材料的應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)利用碳二亞胺EDC作為羧基載體LX-1000IDA的活化劑，通過脂肪酶的表面氨基，將脂肪酶固定于羧基載體上達(dá)到固定化的目的，形成固定化海洋脂肪酶IDA-LIPASE。結(jié)果如下：1) 篩選出的固定化方案為將載體、EDC和游離酶同時加入反應(yīng)管，在此基礎(chǔ)上利用單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett Burman試驗(yàn)、正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化固定化條件為：pH 4.5、載體量0.2 g、時間6 h、溫度25 ℃、EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%；2) pH、時間、載體量是對固定化酶的活性影響顯著的因素，這3個因素的影響排序是：pH>載體量>時間；3) 模擬擴(kuò)大固定化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：擴(kuò)大10倍，獲得的固定化酶的活性由114 U/g提高到210 U/g；4) 相比于游離酶，固定化脂肪酶IDA-LIPASE最適反應(yīng)溫度提高10 ℃，最適反應(yīng)pH向堿性方向移動0.5，重復(fù)使用性良好，重復(fù)催化第7次還剩余40%左右的酶活，可以長時間耐受70 ℃或更高的高溫，另外，在4 ℃保存30 d后剩余84.6%酶活，具有良好的儲存穩(wěn)定性。

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的固定化條件，基于羧基載體所制備的固定化酶IDA-LIPASE具備較好的環(huán)境耐受性、操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，同時，具備擴(kuò)大化生產(chǎn)的潛力，在實(shí)際的工業(yè)制備和催化反應(yīng)中能夠發(fā)揮比較穩(wěn)定的催化能力，具有較好的工業(yè)應(yīng)用價值，可以進(jìn)一步應(yīng)用于污水凈化、皮革處理、食品添加劑中酯類合成、香料合成和生物柴油生產(chǎn)等實(shí)際生產(chǎn)的嘗試。例如，可以開發(fā)該固定化脂肪酶用于合成酯類食品添加劑[29]，開發(fā)該固定化脂肪酶合成香料產(chǎn)品[30]；此外，還可以嘗試開發(fā)該固定化脂肪酶合成生物柴油[31]。固定化脂肪酶制劑在化工、能源和環(huán)境保護(hù)等諸多工業(yè)領(lǐng)域都具有巨大應(yīng)用價值和潛力。