邱虎森 ，甄 博 *，周新國

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)田灌溉研究所，河南 新鄉(xiāng)453002； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 商丘農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，河南 商丘 476000）

0 引 言

【研究進(jìn)展】目前，氣候變暖已成為影響生態(tài)平衡和人類發(fā)展的全球性問題。隨著氣候變暖趨勢的加劇，尤其是在作物生育期內(nèi)，極端高溫氣候出現(xiàn)頻率的增加，無疑成為影響作物生長和生產(chǎn)的致災(zāi)性因子[1-2]。每年的7 月中旬至8 月中旬為全國范圍內(nèi)的高溫多發(fā)期，正值單季稻拔節(jié)期，這無疑會影響到水稻的光合作用及營養(yǎng)生長[3]。水稻在遭受高溫脅迫時，會通過調(diào)節(jié)生理生化過程抵御和減輕高溫傷害[4]，其代謝過程的變化通過影響根系沉積物質(zhì)形態(tài)及含量的改變進(jìn)而影響到土壤微環(huán)境和微生物群落結(jié)構(gòu)及功能[5]。

根際是受植物根系活動的影響，在物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)上不同于土體的微域土區(qū)，也是微生物聚集和生長的熱區(qū)，是植物根系與土壤微生物之間相互作用所形成的獨(dú)特圈帶[6-8]。細(xì)菌作為土壤微生物中的主要類群，由于其在數(shù)量、種類和功能多樣性上的優(yōu)勢，使其在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起著不可忽視的作用[9]。根際細(xì)菌通過根系與地上植物緊密聯(lián)系，地上植物可以通過凋落物以及根系分泌物等形式影響土壤理化性質(zhì)及微環(huán)境，進(jìn)而影響細(xì)菌種群和功能。土壤細(xì)菌作為養(yǎng)分循環(huán)的驅(qū)動者，影響著土壤養(yǎng)分形態(tài)及含量，根際細(xì)菌及其種群結(jié)構(gòu)可以通過調(diào)整功能代謝過程調(diào)整土壤養(yǎng)分形態(tài)，進(jìn)而影響作物對土壤養(yǎng)分的吸收以及作物對外界環(huán)境脅迫的防御能力[10]?！厩腥朦c(diǎn)】因此，了解根際細(xì)菌代謝功能特性對環(huán)境脅迫的響應(yīng)規(guī)律對于更好的理解土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能、生物地球化學(xué)循環(huán)具有重要作用。眾所周知，土壤微生物通過編碼相關(guān)酶的功能基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)相關(guān)酶的合成及生理代謝功能，而這些編碼序列作為土壤微生物功能標(biāo)記物，成為深入了解微生物功能多樣性信息與土壤物質(zhì)循環(huán)之間關(guān)系的紐帶[11]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物多樣性及種群結(jié)構(gòu)對環(huán)境的響應(yīng)特征有了深入研究，但相應(yīng)的細(xì)菌生理代謝功能基因表達(dá)對環(huán)境脅迫的響應(yīng)還不清楚。

PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）作為細(xì)菌功能和代謝的分析軟件，結(jié)合高通量測序技術(shù)可以預(yù)測細(xì)菌代謝功能譜，有助于根際細(xì)菌群落組成和功能分析。

【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究采用Miseq 測序技術(shù)，在對水稻根際細(xì)菌進(jìn)行測序分析多樣性和組成的同時，通過OTU 進(jìn)行COG（Clusters of Orthologous Groups）功能注釋分析高溫脅迫對水稻根際土壤細(xì)菌組成及參與細(xì)菌生理代謝功能基因的影響?！颈狙芯康闹匾饬x】這為深入了解水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及功能基因組成對高溫脅迫的響應(yīng)和微生物養(yǎng)分代謝機(jī)制提供理論支撐，同時為在極端氣候條件下如何改善田間管理模式，防止災(zāi)害的發(fā)生提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

水稻盆栽試驗在河南商丘農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站（北緯34°35.22′，東經(jīng)1115°34.52′）開展。供試土壤為砂壤質(zhì)潮土。采用多點(diǎn)采樣法采集耕層（0～20 cm）土樣，樣品去除動植物殘體及碎石，風(fēng)干后過2 mm 篩，然后充分混合，按照四分法取少量混合樣品測定土壤基本理化指標(biāo)，其中土壤有機(jī)碳量為12.90 g/kg，全氮量為0.78 g/kg，剩余土壤混合均勻用于盆栽試驗。

選擇健康且長勢一致的水稻（獲稻008）幼苗移栽到裝有10 kg 風(fēng)干土的塑料桶（高29.5 cm、桶口直徑25 cm、桶底直徑21.5 cm）。在水稻苗移栽定植后（每盆3 棵水稻苗），每桶施入相當(dāng)于1.5 g 純氮的尿素，相當(dāng)于1 g 純磷（P2O5）的過磷酸鈣和相當(dāng)于1 g純鉀（K2O）的氯化鉀。在水稻對溫度較敏感的拔節(jié)期進(jìn)行為期7 d 的高溫脅迫處理。試驗設(shè)置對照Control（淹水5 cm）和高溫T（淹水5 cm）2 個處理，其中，對照組在戶外完成，高溫脅迫處理在人工氣候室內(nèi)完成。人工氣候室模擬溫度設(shè)定具體為：00:00—05:00 為30 ℃，06:00 為31 ℃，07:00 為32 ℃，08:00 為33 ℃，09:00 為34 ℃，10:00 為35 ℃，11:00為37 ℃，12:00 為39 ℃，13:00 為41 ℃，14:00 為40 ℃，15:00為39 ℃，16:00為37 ℃，17:00為35 ℃，18:00 為34 ℃，19:00 為33 ℃，20:00 為32 ℃，21:00為31 ℃，22:00—24:00 為30 ℃。對照在戶外完成

1.2 樣品采集與測定

1.2.1 樣品采集

在高溫脅迫處理結(jié)束后，先將帶土水稻植株從塑料桶中輕輕拔出，然后將與根系緊密結(jié)合的土壤取下為根際土。根際土混合均勻后，經(jīng)過液氮速凍處理后，保存在-80 ℃冰箱，用于細(xì)菌群落多樣性和代謝功能基因分析。

1.2.2 樣品測定

采用Fast DNA?SPIN 試劑盒（Qbiogene Inc., USA）提取土壤總DNA，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。在設(shè)計測序引物時，在序列中添加bar-code 序列以區(qū)分各個樣品測序數(shù)據(jù)。用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[12]引 物 對V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700 型）。擴(kuò)增體系為20 ul，4 ul 5×FastPfu 緩沖液，2 ul 2.5 mM dNTPs，0.8 ul 引物（5 uM），0.4 ul FastPfu 聚合酶；10 ng DNA 模板。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST（Promega, USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)定量結(jié)果和測序量要求，取PCR 產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫。構(gòu)建好的文庫在Illumina Miseq PE300 測序平臺測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接，使用UCHIME 軟件剔除嵌合體，使用的 UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列 進(jìn) 行 OTU 聚 類。 利 用 RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計在Excel 2007 中完成，α-多樣性的計算在QIME1.80 中完成；細(xì)菌群落功能基因預(yù)測基于PICRUSt 分析實(shí)現(xiàn)[13]，通過PICRUSt（PICRUSt 軟件存儲了greengene ID 對應(yīng)的COG 信息）對OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并去除16S marker gene 在物種基因組中的copy 數(shù)目的影響；然后通過每個OTU 對應(yīng)的greengene ID，獲得OTU 對應(yīng)的COG 家族信息；并計算各功能基因?qū)?yīng)的各COG，根據(jù)COG 數(shù)據(jù)庫的信息，從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析各COG的描述信息，以及其功能信息，并能根據(jù)OTU 豐度計算各功能類別的豐度。

該分析可在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/中在線實(shí)現(xiàn)?；赗3.4.3 的vegan 包，采用非參數(shù)多元統(tǒng)計比對組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異；基于SPSS16.0配對T 檢驗研究組間微生物α 多樣性的差異；基于STAMP 的Welch's t-test 檢驗對比組間功能豐度差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)的差異

基于Miseq 測序結(jié)果，對水稻根際細(xì)菌在分類水平上進(jìn)行比對分析，共發(fā)現(xiàn)40 門、100 綱、194 目、366 科、626 屬。其中門水平上變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，占總細(xì)菌豐度的93%以上，而其余32 個門僅占7%左右（圖1）。配對T 檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫未改變水稻根際細(xì)菌群落的覆蓋度、豐富度和均勻度，但顯著提高了細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)（表1，p<0.05）。與對照相比，雖然高溫處理未改變水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（表2），但LEfSe（LDA閾值為2）差異分析發(fā)現(xiàn)處理間仍有種群富集的差異，其中相對豐度較高的放線菌門、厚壁菌門和棲熱菌門在對照組中顯著富集，而芽孢單菌門、浮霉菌門、Latescibacteria、螺旋菌門、Microgenomates 和Candidatus_Berkelbacteria 等5 個門類主要在高溫脅迫處理中富集（圖1）。與對照相比，高溫脅迫提高了在屬（417∶444）水平上根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中的連接數(shù)，其中正相關(guān)連接數(shù)為（對照∶高溫脅迫=243∶273），負(fù)相關(guān)連接數(shù)為（對照∶高溫脅迫=174∶171）（圖2）。

圖1 基于門水平的細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)差異 Fig.1 Difference of bacterial community structure between treatments based on phylum

表1 基于OTU 水平的細(xì)菌α 多樣性 Table 1 Bacterialα-diversity based on OTU

表2 處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異 Table 2 Difference of bacterial community structure between treatments

圖2 基于屬水平的物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析 Fig.2 Network analysis on genus level

2.2 水稻根際細(xì)菌COG 功能分類及差異

通過COG 數(shù)據(jù)庫比對，所有基因的功能可歸為24 個功能亞類。其中與新陳代謝相關(guān)的基因相對豐度占40%～41%，其中以能量代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主，說明高溫脅迫并未改變細(xì)菌以能量獲取為核心的代謝活動。與細(xì)胞加工和信號傳遞相關(guān)的基因相對豐度占24%～25%，與信息儲存和加工以及功能預(yù)測和功能未知相關(guān)的基因相對豐度各占約17%，而與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及動力相關(guān)的基因相對豐度小于1%。Welch'st 檢驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫脅迫顯著提高了與細(xì)胞加工和信號傳遞基因相對豐度，但同時顯著降低參與新陳代謝和信息儲存和加工基因的相對豐度（圖3，p<0.05）。

基于24 個功能亞類，比較組間豐度差異發(fā)現(xiàn)高溫脅迫主要提高了參與細(xì)胞加工和信號傳遞基因相對豐度，主要包括細(xì)胞運(yùn)動、信號傳導(dǎo)機(jī)制、胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)、分泌和囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞壁/膜/器形成基因的相對豐度。但高溫脅迫顯著降低了參與新陳代謝的某些功能基因相對豐度，如氨基酸運(yùn)輸和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次生代謝生物合成；同時，高溫脅迫降低了參與翻譯的相關(guān)基因的豐度（圖4，p<0.05）。

圖3 基于COG 數(shù)據(jù)庫的水稻根際土壤細(xì)菌功能基因熱圖 Fig.3 Heatmap of bacterial COG function classification in rice rhizosphere

圖4 基于COG 功能分類的水稻根際土壤細(xì)菌功能基因相對豐度差異 Fig.4 Difference of the relative abundance of bacterial functinonal genes in rice rhizosphere based on COG function classification

3 討 論

3.1 高溫脅迫對根際細(xì)菌多樣性及種群結(jié)構(gòu)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理可以提高根際土壤細(xì)菌Shannon 多樣性，說明高溫條件下根際土壤有更多可被微生物利用的養(yǎng)分和有機(jī)物質(zhì)。在外界環(huán)境水分充足的條件下，高溫可以提高水稻氣孔導(dǎo)度，促進(jìn)光合作用[14-15]。植物根系可以將輸入到根部的光合碳釋放到土壤中為根際周圍微生物生長和活性的提高提供更多的碳源[16-17]。這些改變都可能會影響水稻根際周圍環(huán)境，提高根際土壤的異質(zhì)性，從而導(dǎo)致根際細(xì)菌多樣性的提高。

與對照相比，高溫處理并未改變水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，說明水稻可通過生理調(diào)節(jié)過程維持了土壤大環(huán)境的穩(wěn)定，并未造成根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變。影響土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的因素主要是土壤環(huán)境的改變引起的，研究發(fā)現(xiàn)溫度和水分是影響土壤微生物活性、數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的2 個關(guān)鍵因子[18]。高溫脅迫可以直接影響細(xì)菌群落組成[19-20]，但這種影響受土壤水分的調(diào)節(jié)，對于淹水稻田土壤，充足的水分可能會削弱甚至抵消高溫脅迫對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。另一方面，水稻會通過一系列生理過程的調(diào)節(jié)來適應(yīng)高溫脅迫，在這一過程中可能會導(dǎo)致根際泌氧、根系分泌物形態(tài)和含量的變化等，這些都可能會抵消高溫脅迫對細(xì)菌菌群的影響[21]，從而有利于水稻根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。水稻根系分泌物對根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的選擇性塑造可能會在不影響群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的情況下促使某些物種門類的富集。也有可能，在高溫脅迫時，水稻通過主動增加氣孔導(dǎo)度，提高蒸騰速率等方式來降低葉片溫度，以減少傷害，并未對根際微環(huán)境和細(xì)菌菌群產(chǎn)生影響[21-22]。

基于物種網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析的結(jié)果，與對照相比，高溫脅迫提高了在屬水平上根際細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中總連接數(shù)和正相關(guān)連接數(shù)所占比例，說明根際土壤中微生物之間的競爭關(guān)系減弱，共生關(guān)系增強(qiáng)。究其原因，可能由于高溫促進(jìn)了水稻光合作用及根際沉積碳的形成，為微生物生長提供了充足的碳源，降低物種之間因為能量匱缺引起的競爭關(guān)系[23-24]。放線菌門和厚壁菌門作為參與土壤穩(wěn)定性有機(jī)碳分解的關(guān)鍵門類[25]，在對照組中的富集在一定程度上說明土壤可利用碳源的不足使對照組中微生物之間的競爭關(guān)系強(qiáng)于高溫脅迫處理。另外，高溫引起的植物根系生理代謝使根際微環(huán)境更適合微生物的生存，從而有利于微生物共生關(guān)系的發(fā)生。

3.2 高溫脅迫對細(xì)菌代謝功能基因的影響

有研究認(rèn)為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變可能會影響微生物功能組成[26-27]，而本研究發(fā)現(xiàn)即使細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，細(xì)菌的功能基因組成也會存在差異。從本研究的細(xì)菌組成來看，70%以上的細(xì)菌活性基因主要源于變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和綠彎菌門等優(yōu)勢門類。

土壤微生物基因表達(dá)特征及功能代謝過程的改變反映了微生物對環(huán)境的適應(yīng)性和應(yīng)激性[28]。高溫脅迫可以直接或者間接通過影響作物生長改變根際土壤微環(huán)境，諸如根際土壤pH 值、含氧氣量、養(yǎng)分形態(tài)等，進(jìn)而影響根際細(xì)菌的生長和功能組成。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫條件下，細(xì)菌細(xì)胞壁/膜/器形成等與細(xì)胞過程相關(guān)基因的相對豐度的提高代表著土壤可利用碳源和營養(yǎng)物質(zhì)的提高[29]。與此同時，高溫脅迫主要提高了參與細(xì)胞運(yùn)動、信號傳導(dǎo)機(jī)制、胞內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)、分泌和囊泡運(yùn)輸說明高溫脅迫改變了細(xì)菌細(xì)胞的生長和死亡周期，而這一過程可能有助于提高根際細(xì)菌對因高溫引起的根際微環(huán)境變化的適應(yīng)能力[30]。相反，高溫脅迫降低了氨基酸運(yùn)輸和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、次生代謝生物合成以及參與翻譯的相關(guān)基因的豐度（p<0.05）。說明高溫脅迫對細(xì)菌次生代謝物的形成和蛋白質(zhì)的生物合成過程具有一定的抑制作用，究其原因可能是受由于高溫脅迫導(dǎo)致的水稻根系分泌物多樣性以及分泌物形態(tài)的限制。有研究認(rèn)為，土壤可利用碳源、氮源等養(yǎng)分的高低與細(xì)菌多樣性呈正比[23]，本研究中高溫脅迫可能促進(jìn)了根際土壤微生物對養(yǎng)分的周轉(zhuǎn)代謝過程，同時有助于增強(qiáng)根際土壤微生態(tài)的穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

1）高溫脅迫提高了水稻根際細(xì)菌多樣性，促進(jìn)了豐度相對較低的細(xì)菌門類的富集，加強(qiáng)了細(xì)菌菌群之間共生關(guān)系。

2）高溫脅迫并未改變細(xì)菌以能量獲取為核心的代謝活動，卻促進(jìn)了細(xì)胞的更新速度，降低了參與蛋白代謝的基因表達(dá)。