許云華，周 旋，喬友志

（連云港師范高等專科學(xué)校海洋港口學(xué)院，江蘇，連云港 222006）

辣木（Moringa oleifera Lam.），又名鼓植樹、山葵樹，屬辣木科辣木屬植物。這是一種有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價值的熱帶植物，全株都有利用價值。辣木富含多種人體所需的維生素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪酸、多糖、抗?fàn)I養(yǎng)因子、黃酮和多酚類化合物及氨基酸，可以作為天然營養(yǎng)食物材料。辣木不僅可以直接食用，而且經(jīng)過加工處理后還可以制成保健品。辣木富含植物多糖（Polysaccharide），而植物多糖具有降血糖、降血壓、降膽固醇，護(hù)心、護(hù)肝、治療潰瘍、抗炎抑菌、促進(jìn)凝血、抗腫瘤[1]等藥理作用，以及解熱、利尿、止疼、預(yù)防心臟病等功效。植物多糖作為一種保健食品已經(jīng)進(jìn)入人們的實(shí)際生活，如黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等方面具有重要的作用[2]，因此辣木有非常廣闊的經(jīng)濟(jì)開發(fā)前景。

多項研究顯示，植物多糖經(jīng)分子修飾后，其抗氧化活性和藥理活性都有所增強(qiáng)；經(jīng)過化學(xué)修飾后，其分子量的大小、空間結(jié)構(gòu)及取代基會發(fā)生改變。植物多糖的硫酸化修飾是植物多糖分子修飾中應(yīng)用較為廣泛的一種修飾方法，許多植物多糖經(jīng)過硫酸化修飾后不僅生物活性增強(qiáng)，抗病毒、抗腫瘤、抗免疫缺陷的效能也大為提高[3-4]。Jaiswal 和Yassa 等人發(fā)現(xiàn)辣木葉的水提取物含有降血糖有效成分[5-6]。Satish 等人的實(shí)驗(yàn)表明，辣木在經(jīng)過熱水浸提后提取出的辣木多糖具有抗突變活性[7]。Choudhary 等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)辣木多糖具有抗?jié)冏饔肹8]。實(shí)驗(yàn)主要研究用熱水浸提取法提取辣木中的植物多糖，并對提取到的辣木粗多糖進(jìn)行硫酸化修飾，以研究其抗氧化活性。

一、實(shí)驗(yàn)材料與所用設(shè)備

（一）材料與試劑

材料：辣木葉（產(chǎn)地為云南保山，云南廣昆堂農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

試劑：無水乙醇，95%乙醇，100%三氯乙酸（TCA），氫氧化鈉，硫酸化試劑（正丁醇、硫酸銨、濃硫酸），硫酸鉀，鹽酸，氯化鋇，明膠，硫酸亞鐵，水楊酸，過氧化氫，Tris 鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl），焦性沒食子酸。以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

（二）儀器與設(shè)備

CPA225D 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），30B 萬能粉碎機(jī)（無錫市中銀機(jī)械制造有限公司），XMTD-204 恒溫水浴鍋（常州諾基儀器有限公司），島津UV2550 分光光度計（日本島津有限公司），低速離心機(jī)LD5-10（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），90-2 磁力攪拌器（上海申勝生物技術(shù)有限公司），VERTEX70紅外光譜儀（德國BRUKER 公司），ALPHA1-4 型真空冷凍干燥機(jī)（德國CHRIST 公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）辣木多糖的提取

將辣木葉置于烘箱內(nèi)，以80 ℃干燥，粉碎后過40 目篩。采用熱水浸提法，稱取500 g 辣木葉粉末，按料液比1∶20（g/mL）量取去離子水，置于燒杯中混合均勻，水浴溫度80 ℃下提取2 次后將提取液合并；采取真空濃縮，將提取液濃縮至原體積的1/5。采用TCA 法去蛋白，以1∶10 比例將100%的TCA 加入到樣品中，置于冰箱中冷藏沉淀1 h，離心取上清。醇沉后取上清液緩緩倒入95%乙醇，并且用玻璃棒緩緩攪拌，使乙醇濃度達(dá)到80%，經(jīng)過濾、離心、干燥即為辣木粗多糖[9]。

（二）辣木多糖的硫酸化修飾

在冰浴條件下，錐形瓶中加入硫酸化試劑充分?jǐn)嚢琛?.3 g 辣木多糖加入裝有硫酸化試劑的錐形瓶中，0 ℃條件下攪拌直至多糖充分溶解。用濃度為2.5 mol/mL 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)，使溶液顯中性（pH 值為7.0—8.0）。以離心法取沉淀加入透析袋透析，經(jīng)48 h后減壓濃縮體積，降低到原始體積的1/5。按照1∶3比例加入95%乙醇醇沉，然后取沉淀物以4000 r/min離心10 min，去除上清液，經(jīng)真空冷凍干燥即為硫酸化辣木多糖。

（三）硫酸化辣木多糖的取代度測定

采用硫酸鋇比濁法測定硫酸根離子含量[10]。分別吸 取0.02 mL、0.06 mL、0.10 mL、0.14 mL、0.18 mL、0.20 mL 的0.6 mg/mL 硫酸鉀溶液加入試管，用濃度為1 mol/L 鹽酸將六個試管補(bǔ)加至200 μl，再加入3%三氯乙酸3.8 mL 和0.5%氯化鋇明膠溶液1.0 mL后充分混勻，靜置10 min，在360 nm 波長處檢測吸光度值A(chǔ)1，用明膠溶液測吸光度值A(chǔ)2，使用（A1-A2）對硫酸根的質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在100 ℃水浴下，用1 mol/L 鹽酸與硫酸化辣木多糖制備2 mg/mL 儲存液，4 ℃條件下保存，然后吸取0.2 mL 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定A1、A2。根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算硫酸基含量（S）并計算取代度（DS）。取代度的計算式為：

取代度（DS）=1.62×S/（32-1.02×S）

（四）單因素實(shí)驗(yàn)

固定稱取辣木多糖0.3 g，取正丁醇3 mL。選取硫酸化制備反應(yīng)時間、濃硫酸體積和硫酸銨添加量作為制備硫酸化辣木多糖單因素實(shí)驗(yàn)的考察因素。

1.反應(yīng)時間對辣木多糖硫酸化效果的影響

固定取濃硫酸7.5 mL，硫酸銨用量為0.125 g，反應(yīng)時間分別為20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h，測定取代度。

2.濃硫酸體積對辣木多糖硫酸化效果的影響

固定取硫酸銨0.125 g，反應(yīng)時間為30 min，濃硫酸用量分別為2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL、12.5 mL，測定取代度。

3.硫酸銨用量對辣木多糖硫酸化效果的影響

固定取濃硫酸7.5 mL，反應(yīng)時間30 min，硫酸銨用量分別為0.1 g、0.125 g、0.150 g、0.175 g、0.20 g，測定取代度。

（五）正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取硫酸化辣木多糖制備的反應(yīng)時間、濃硫酸用量、硫酸銨用量作為考察因素，以取代度為指標(biāo)，選取L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)（見表1）。

表1 因素水平表

（六）紅外光譜檢測

利用最優(yōu)化條件制備硫酸化辣木多糖。分別取2 mg 辣木多糖和硫酸化辣木多糖，用研缽將多糖與溴化鉀充分研磨混合后壓片，在4000 cm-1—400 cm-1區(qū)間內(nèi)對辣木多糖和硫酸化辣木多糖進(jìn)行紅外光譜檢測。

（七）抗氧化活性測定

取正交試驗(yàn)最優(yōu)條件下制得的硫酸化辣木多糖，測定其抗氧化活性。

1.羥基自由基（·OH）的清除率測定

取4 個干凈的試管，分別加入濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL，再加入1 mL 的6 mmol/L 硫酸亞鐵，1 mL 的6 mmol/L水楊酸，最后加入1 mL 的6 mmol/L 過氧化氫啟動反應(yīng)，搖動試管使溶液混合均勻。置于37 ℃水浴下反應(yīng)1 h，然后于510 nm 處測定不同濃度樣品及對照組吸光度值（對照組以蒸餾水代替多糖樣品溶液）[11]。對照組吸光度值記為Ai，樣品吸光度值記為Aj[12]。清除率計算式為：

清除率（%）=[（Ai-Aj）/Ai]×100%

2.超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率測定

分別取濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL 的樣品溶液各1 mL 加入到試管中，分別加入0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH8.0）4.0 mL，震蕩搖勻，然后置于25 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min；加入2.5 mmol/L 的焦性沒食子酸溶液0.4 mL，使內(nèi)容物混合均勻，置于25 ℃水浴條件下充分反應(yīng)3 min；再加入2 mol/L 鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)[13]。在325 nm 處測定吸光度，對照組吸光度值記為Ai，樣品吸光度值記為Aj[14]。清除率計算式為：

清除率（%）=[（Ai-Aj）/Ai]×100%

3.二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除率測定

取5 個試管，分別加入20μl、40μl、60μl、80μl、100 μl 濃度為1.01×10-1mg/mL 的DPPH·溶液，加多糖溶液至4 mL，充分混勻。樣品組：3.5 mL濃度為0.1 g/L二苯代苦味酰基自由基的50%乙醇溶液，0.5 mL樣品溶液。對照組：3.5 mL 濃度為0.1g/L 二苯代苦味?；杂苫?0%乙醇溶液，0.5mL 蒸餾水?？瞻捉M：3.5 mL無水乙醇，0.5 mL 樣品溶液[15]。將樣品對應(yīng)溶液分別加入10 mL 試管中，密封，充分混勻，靜置30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，空白對照組的吸光度值記為Ai，樣品溶液的吸光度值記為Aj[16]。清除率計算式為：

清除率（%）=[（Ai-Aj）/Ai]×100%

三、結(jié)果與分析

（一）單因素實(shí)驗(yàn)

1.硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制硫酸基標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見圖1。標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：y=1.2735x+0.0415；相對系數(shù)：R2=0.9959。

圖1 硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.反應(yīng)時間對硫酸化效果的影響

隨著反應(yīng)時間的增加，硫酸化辣木多糖的取代度顯著變大。反應(yīng)30 min 時硫酸化辣木多糖的取代度達(dá)到最大值，為0.56；反應(yīng)時間大于30 min 時，取代度減?。ㄒ妶D2）。數(shù)據(jù)表明，適當(dāng)增加反應(yīng)時間，取代度會增大，但反應(yīng)時間長于30 min 時，取代度會降低。這可能是由于反應(yīng)時間過長，造成一部分硫酸化多糖的硫酸基游離出來[17]，導(dǎo)致取代度降低。因此，選擇最適合辣木多糖硫酸化反應(yīng)時間30 min，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 反應(yīng)時間對取代度影響

3.濃硫酸體積對硫酸化效果的影響

反應(yīng)開始后，當(dāng)濃硫酸體積為2.5 mL 至7.5 mL時，取代度呈上升趨勢。當(dāng)濃硫酸的體積為7.5 mL時，取代度達(dá)到最高值，為0.413；當(dāng)濃硫酸體積超過7.5 mL 時，取代度降低（見圖3）。原因可能是由于濃硫酸過多，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞[17]，導(dǎo)致取代度降低。在這個實(shí)驗(yàn)中，濃硫酸的最適體積為7.5 mL。

圖3 濃硫酸體積對取代度的影響

4.硫酸銨用量對硫酸化效果的影響

反應(yīng)開始后，硫酸銨用量為0.1 g—0.125 g 時，取代度呈上升趨勢，當(dāng)硫酸銨添加量為0.125 g 時，取代度達(dá)最大值0.631，繼續(xù)加大硫酸銨用量，取代度則下降（見圖4）。因此，硫酸銨的最佳添加量為0.125 mg。

圖4 硫酸銨用量對取代度的影響

（二）正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按表1 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2 極差分析可知RC＞RA＞RB，即硫酸銨用量對辣木多糖的硫酸化影響最大，反應(yīng)時間和濃硫酸體積對硫酸基取代度的影響相對較小，最優(yōu)條件組合是A1B2C2，即硫酸化辣木多糖的制備反應(yīng)時間為30 min，濃硫酸加入量為7.5 mL，硫酸銨添加量為0.125 mg，在此條件下取代度為0.535。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（三）紅外光譜檢測

辣木多糖及硫酸化辣木多糖紅外光譜結(jié)構(gòu)表征見圖5。在3450 cm-1出現(xiàn)O-H 伸縮針對吸收峰，羥基與濃硫酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致硫酸化辣木多糖在此處O-H 的羥基峰明顯減弱。與辣木多糖相比，硫酸化辣木多糖出現(xiàn)3 個新特征峰，在1240 cm-1和1150 cm-1處均形成了S=O 特征峰，C-O-SO3的伸縮振動引起810 cm-1處出現(xiàn)特征峰，由此可初步判斷硫酸化修飾是成功的[18]。

圖5 辣木多糖及硫酸化辣木多糖的紅外譜圖

（四）抗氧化活性測定

1.羥基自由基（·OH）的清除率

隨著多糖溶液濃度的增大，清除率不斷提高，硫酸化辣木多糖對·OH 的最大清除率為79.8%，比未經(jīng)硫酸化多糖的最大清除率（56.29%）提高了23.51%（見圖6）。實(shí)驗(yàn)表明，硫酸化后的辣木多糖清除·OH的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

圖6 羥基自由基（·OH）的清除率

2.超氧陰離子自由基O2-·的清除率

隨著多糖濃度升高，辣木多糖及硫酸化辣木多糖對O2-·的清除率逐漸增大。糖濃度為0.8 mg/mL 時，硫酸化的辣木多糖對O2-·的清除率提高了33.32%（見圖7）。實(shí)驗(yàn)表明，硫酸化后的辣木多糖清除O2-·的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)硫酸化的辣木多糖。

圖7 超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率

3.二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除率

隨著多糖濃度的升高，辣木多糖和硫酸化辣木多糖對DPPH·清除率都增大，經(jīng)過硫酸化的辣木多糖對苯代苦味酰基自由基的最大清除率為65.79%，比未硫酸化的多糖的最大清除率51.23%提高了14.56%（見圖8）。實(shí)驗(yàn)表明，硫酸化后的辣木多糖清除DPPH·的能力比辣木多糖稍有提高。

圖8 DPPH·自由基清除率

綜上，隨著多糖濃度的升高，硫酸化辣木多糖活性較辣木多糖增強(qiáng)，可能是硫酸化修飾伸展了多糖的支鏈，致使多糖·OH 因暴露而改變了親水性，在水溶液中溶解度增強(qiáng)，抗氧化活性也得到增強(qiáng)。邵力成等人[19]的研究表明，海洋真菌多糖硫酸化的活性隨著硫酸基取代度的增加而增強(qiáng)，但王雁等人[20]的虎奶多糖研究表明，硫酸化多糖的取代度高，抗氧化活性不一定強(qiáng)。因此，硫酸化多糖的抗氧化活性不僅與取代度有關(guān)，而且與硫酸基取代位置及其空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。至于修飾多糖的位置以及空間構(gòu)象不明確等問題，則有待進(jìn)一步研究。

四、結(jié)論

紅外譜圖對比表明，用濃硫酸、正丁醇以及硫酸銨作為硫酸化試劑，對辣木多糖進(jìn)行硫酸化結(jié)構(gòu)修飾是可行的。硫酸化辣木多糖制備最優(yōu)條件為：反應(yīng)時間30 min，濃硫酸體積7.5 mL，硫酸銨用量0.125 g，在此條件下硫酸化辣木多糖的取代度是0.535。經(jīng)過硫酸化后的辣木多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、二苯代苦味?；杂苫那宄识加忻黠@提高?？梢?，硫酸化修飾可以增強(qiáng)辣木多糖的抗氧化活性。