李石巖， 馬志紅， 李燕波， 曹 雷， 郝旭峰， 何志良， 張 晗， 王承陽

(河北省承德市中心醫(yī)院， 河北 承德 067000)

與許多其他器官不同的是，由于外傷或其他原因?qū)е碌娜梭w骨骼受損會自發(fā)愈合。關(guān)于骨修復，其利用骨本身內(nèi)源性再生的潛能，通過增加骨體積，繼而恢復原始骨結(jié)構(gòu)的過程?？偟膩碚f，骨修復的過程快速且高效。但在一些病理狀態(tài)下，骨修復過程可能會受到阻礙。具體講，大約有10%的骨折患者并發(fā)骨延遲愈合或骨不連，同時可能出現(xiàn)骨缺損[1]。另外，在某些骨修復的過程，比如存在骨缺損的植骨、顱面的重建，有一部分患者重建失敗，可能原因包括但不拘泥于血液供應(yīng)較差、骨膜受損嚴重、老年或并發(fā)骨質(zhì)疏松誘導的骨祖細胞數(shù)量降低、手術(shù)固定欠佳和損傷部位發(fā)生感染，其中骨細胞凋亡發(fā)揮重要作用。骨損傷后的骨細胞凋亡由兩種途徑介導不同的過程：血管生成或從已有血管和血管生成中獲得的新毛細血管，它們通過重建骨內(nèi)血管和血液供應(yīng)促進骨修復，有助于髓腔的修復，改善骨愈合過程中的生物力學性能[2]。富含血小板的血漿首先被認為是人類牙科和口腔頜面外科領(lǐng)域骨和組織修復的有效藥物，其次是整形外科領(lǐng)域皮膚移植傷口愈合的改善證據(jù)。濃縮生長因子(Concentrated growth factor，CGF)是新一代血小板濃縮物，許多臨床研究表明，CGF可以作為一種骨移植材料，研究還表明，CGF可以增加骨形成和細胞分化，以及促進細胞增殖和神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌[3,4]。然而，CGF對骨細胞凋亡的影響尚不清楚。本研究選擇復制體外小鼠骨樣細胞(MLO-Y4細胞)缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)模型，進一步觀察CGF對缺血再灌注誘導的MLO-Y4細胞凋亡的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料:試劑:蛋白定量BCA試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司；PMSF購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；caspase-3活性檢測試劑盒購自美國的BioVision公司；青霉素/鏈霉素購自美國的Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基和PBS購自美國的Coring公司；平臺離心機購自購自意大利的Medifuge公司；平臺倒置顯微鏡購自日本的Nikon公司；細胞總RNA提取試劑盒、一步法實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒購自日本的TaKaRa公司。

1.2MLO-Y4細胞的培養(yǎng):MLO-Y4細胞購自ATCC(美國)，MLO-Y4細胞培養(yǎng)于含5%小牛血清、5%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、2mM L-谷氨酰胺、72mg/L的青霉素、100mg/mL的鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。每3d傳代一次。在6孔板中以2×106細胞/皿的密度接種MLO-Y4細胞，培養(yǎng)24h。MLO-Y4細胞I/R模型制備:正常培養(yǎng)MLO-Y4細胞72h后，給予“缺血緩沖液”刺激，建立缺血模型[5]，缺血緩沖液包含下述物質(zhì)(mmoL/L):118 NaCl、24NaHCO3、1.0 NaH2PO4、2.5 CaCl2-2H2O、1.2 MgCl2、20 乳酸鈉、16 KCl 和 10 脫氧葡萄糖。實驗組分別加入含1%、5%、10%CGFe的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育10min，然后用1xPBS清洗細胞，實驗組分別加入含有1%、5%、10%CGFe的缺血緩沖液，處理后的細胞放置溫度為37℃，CO2濃度為5%細胞培養(yǎng)箱中孵育，處理2h，將缺血緩沖液換為含有1%、5%、10%CGFe無血清培養(yǎng)基，再灌注時間為24h。對照組細胞，無血清培養(yǎng)基處理2h，完全培養(yǎng)基處理24h。

1.3濃縮生長因子對內(nèi)皮細胞凋亡的作用

1.3.1濃縮生長因子提取液(concentrate growth factor extracts，CGFe)的制備:本實驗已得到承德市中心醫(yī)院倫理委員會的批準，志愿者對過程均知情并同意。篩選現(xiàn)場，確定志愿者不吸煙，進行血常規(guī)檢查顯示血小板計數(shù)位于正常范圍，篩選出的健康男性志愿者年齡35～45歲，共4名，獲得每位志愿者的CGFe，混勻。不同濃度的CGFe均含有10%FBS。

1.3.2caspase-3活性的檢測:檢測caspase-3的活性所用的方法為熒光法。將細胞用1×lysis buffer裂解，4℃,14000rpm/min,離心10min，分別取出上清液，將上清液及試劑盒熒光底物同時加入96孔板，在最佳波長為405 nm測定數(shù)值，作為基礎(chǔ)值，將96孔板放置37℃孵箱，避光孵育1.5 h，上機測定數(shù)值。應(yīng)用BCA法測定細胞的蛋白濃度，進行數(shù)據(jù)處理，即2次讀取的吸光度值的差值除以對應(yīng)細胞的蛋白濃度即為caspase-3活性。

1.3.3Real-time PCR分析

1.3.3.1mRNA提取、反轉(zhuǎn)及分析:每個孔中加入1mL Trizol，13500rpm，離心5min，分別加入氯仿、異丙醇、75%乙醇、13500rpm10min4℃，干燥10min，加入DEPC水溶解。將溶于DEPC水中的mRNA吸取1-2μL于Nano-drop上，測定mRNA濃度及純度(260/280)。根據(jù)定量結(jié)果，計算反轉(zhuǎn)mRNA的量，一般反轉(zhuǎn)2μg mRNA/管。

反轉(zhuǎn)流程如下：①mRNA(2μg)+random primer 1μL+DEPC ddH2O=10μL 混勻后，72℃ 10 min，冰浴10min。②上述體系分別加入各個需要反轉(zhuǎn)mRNA的RNase-free的EP管中，置于72℃，10min，再置于冰上，10min。③cDNA合成：上述各管中加入以下試劑：4μL 5×反轉(zhuǎn)錄buffer+2μL 2.5mM dNTP+1μL 逆轉(zhuǎn)錄酶+0.5μL 逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑+1.5μL DEPC水=10μL,使每管的總體系為20μL。④將上述20ul體系混勻，離心后放入PCR儀中，42℃ 1h，95 ℃ 5min，0℃ forever。⑤將制備好的cDNA，保存在-20℃。

1.3.3.2Realtime PCR分析如下：①準備引物：將引物稀釋為工作液(10μM)；實驗中所用到的引物包括：見表1。②打開Realtime-PCR儀，設(shè)置反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 45s(45 個循環(huán))；熔解曲線：55℃，95℃(每個循環(huán)增加0.5℃，81個循環(huán))。③每個反應(yīng)體系按以下混勻：1μL cDNA+1μL 靶基因/內(nèi)參的上游引物+1μL 靶基因/內(nèi)參的下游引物+10μL SYBR Green PCR master mix(2×)+ 7μL ddH2O。④將八聯(lián)排放入PCR儀中，填寫板子的布局。⑤點擊“run”之后確認方法正確，再次點擊“run”，彈出“保存”對話框，保存文件。⑥結(jié)束之后，導出數(shù)據(jù)，分析。⑦結(jié)果分析：靶基因相對mRNA 水平=2(CT內(nèi)參-CT靶基因)。

表1 實驗中所用到的引物

2 結(jié) 果

2.1CGFe對H/R狀態(tài)下MLO-Y4細胞的caspase-3活性的影響:與對照(Control,Con)組相比較，缺血再灌注(hypoxia/Reperfusion,H/R)組caspase-3活性明顯升高了119%(2.19%±0.1% vs.1.00%±0.0%, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組caspase-3活性明顯從2.19%±0.1%降低至1.70%±0.1% (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組caspase-3活性明顯從1.70%±0.1%降低至1.47%±0.0% (P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組caspase-3活性明顯從1.47%±0.0%降低至1.18%±0.0%(P<0.05)(圖1)。

2.2CGFe對H/R狀態(tài)下MLO-Y4細胞的Bax mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組Bax的mRNA水平明顯升高(2.72±0.08 vs.1.00±0.03, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從2.72±0.08降低至2.28±0.07 (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從2.28±0.07降低至1.89±0.05(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組Bax的mRNA水平明顯從1.89±0.05降低至1.32±0.07(P<0.05)(P<0.05)(圖2)。

圖2 缺血再灌注MLO-Y4細胞的Bax 的mRNA水平檢測

2.3CGFe對H/R狀態(tài)下MLO-Y4細胞的Bcl-2 mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組Bcl-2的mRNA水平明顯降低(0.53±0.00 vs.1.00±0.02, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.53±0.00升高至0.67±0.01 (P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.67±0.01升高至0.77±0.01(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組Bcl-2的mRNA水平明顯從0.77±0.01升高至0.85±0.01(P<0.05)(P<0.05)(圖3)。

圖3 缺血再灌注MLO-Y4細胞的Bcl-2的 mRNA水平檢測

2.4CGFe對H/R狀態(tài)下MLO-Y4細胞的p53的mRNA的影響:與Con組相比較，H/R組p53的mRNA水平明顯升高(2.01±0.06 vs.1.00%±0.03, P<0.05)。與H/R組相比，H/R+1%CGFe組p53的mRNA水平明顯從2.01±0.06降低至1.55±0.04(P<0.05)；與H/R+1%CGFe組相比，H/R+5%CGFe組p53的mRNA水平明顯從1.55±0.04降低至1.26±0.03(P<0.05)；與H/R+5%CGFe組相比，H/R+10%CGFe組p53的mRNA水平明顯從1.26±0.03降低至1.09±0.02(P<0.05)(P<0.05)(圖4)。

圖4 缺血再灌注MLO-Y4細胞的p53的mRNA水平檢測

3 討 論

骨損傷導致血液供應(yīng)受損，影響骨修復及愈合。如何最大程度降低缺血缺氧導致的骨修復及骨愈合障礙是亟須解決的問題，其中骨細胞凋亡發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們首次研究證實CGFe可抑制缺氧再灌注狀態(tài)下骨細胞的凋亡。

與富含血小板的纖維蛋白的生產(chǎn)類似，CGF的生產(chǎn)過程是完全自然的，無需添加任何生化制劑。因此，CGF避免了免疫反應(yīng)、毒性、交叉污染和倫理問題。此外，CGF由多種生長因子和細胞因子組成，如轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生生長因子和血管內(nèi)皮生長因子[6]，細胞增殖和成骨分化受多種生長因子調(diào)控，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子、血小板生長因子、胰島素樣生長因子等。研究表明，CGF可以增加骨形成，但是CGF對骨損傷修復研究尚不明確，眾所周知，骨細胞凋亡與骨損傷修復障礙的發(fā)展有關(guān)[7]，本研究結(jié)果顯示，10%CGFe的抑制作用明顯比5%CGFe和1%CGFe更強，即在10%濃度以內(nèi)時CGFe抑制凋亡作用與濃度呈正相關(guān)，伴隨caepaes-3活性下降。本研究證明了體外條件下CGF可抑制缺氧再灌注誘導的骨細胞的凋亡，人顱頜面部損傷發(fā)生的機率較身體其他部位高，尤其是下頜骨處于顱頜面部前下端，更易受損。因此，對下頜骨撞擊傷的研究長久以來都是創(chuàng)傷領(lǐng)域的重點。CGF在骨損傷修復中重要作用為下頜骨創(chuàng)傷修復提供了基礎(chǔ)依據(jù)，具有重要的研究意義。