李 媛，華榮茂，段家昕，陳華麗，徐德軍，楊 麗，程建勇，李曉亞，耿果霞，李青旺*

(1.西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

人卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)是由下丘腦控制的垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的糖蛋白類促性腺激素，它是一種由FSHα亞基與FSHβ亞基通過非共價鍵結合形成的異源二聚體糖蛋白[1]。其中FSHα亞基基因編碼了92個氨基酸，包含10個半胱氨酸，形成5個二硫鍵；FSHβ亞基基因編碼了111個氨基酸，其中包含12個半胱氨酸，形成6個二硫鍵[2]。FSH在人體中發(fā)揮重要的作用，在女性體內主要促進子宮內膜的生長、卵泡的發(fā)育和排卵等[3]，在男性體內可以刺激次級精母細胞的發(fā)育以及精子的產生，通過與 LH 及雄激素發(fā)揮協(xié)同作用促進精子的成熟[4]。

FSH在臨床上主要用于輔助生殖方面超數(shù)排卵等功能。目前市場對于FSH產品的需求巨大，市面上主要有兩種FSH產品，一種是尿源的FSH，另一種是國外進口的基因工程重組FSH(rhFSH)蛋白，國內臨床應用上進口rhFSH占據(jù)主要市場。rhFSH相比尿源FSH有純度高、生物活性高、來源均一的特點，且無LH及其他雜蛋白的污染[5]，但是國外進口的rhFSH主要是細胞表達的基因工程產品，受制于細胞表達量低的缺點，生產成本較高，因此進口rhFSH價格較為昂貴。目前動物乳腺制備蛋白藥物是藥物制備的熱門研究領域，動物乳腺制備重組蛋白藥物具備產量高、價格低的優(yōu)勢[6]。但是動物乳腺制備FSH的研究還停留在鼠和兔等小動物層面[7-8]，未見大動物制備FSH相關研究報導。本研究旨在構建重組人FSH基因腺病毒表達載體，利用羊乳腺上皮細胞(GMEC)表達人FSH重組蛋白，并驗證其體外生物學活性，為大動物乳腺制備人FSH奠定前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌株 pAdTrack-CMV、pAdEasy-1購自優(yōu)寶生物；pIRES-FSH-neo3表達載體、pIRES-FSHR-puro3表達載體、HEK293A細胞、HEK293T-FSHR細胞、GMEC細胞、大腸桿菌DH5α、BJ5183菌株由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 T4連接酶、限制性內切酶購自New England Biolabs公司；質粒小提試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司；蛋白質 Marker (MP102)、D2000 DNA Marker、D15000 DNA Marker購自天根生化科技有限公司、SDS Page凝膠試劑盒、ECL超敏化學發(fā)光試劑盒、胎牛血清購自碧云天；His tag標簽蛋白純化試劑盒購自康為世紀；Lipofectamine 2000 脂質體購自Invitrogen公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自Sigma公司；Anti-FSH兔多克隆抗體購自Abcam公司；cAMP檢測試劑盒購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 重組腺病毒載體的構建及鑒定 重組腺病毒穿梭載體的構建是基于實驗室前期已經構建好的pIRES-FSH-neo3表達載體的基礎上亞克隆得到的。根據(jù)GenBank中人FSH的序列(NP_000726.1，NP_000501.1)，以pIRES-FSH-neo3載體為模板，設計上游引物F：AGATCTATGGACTACTACAGGAAGT(BglII)，下游引物R： AAGCTTCTAATGATGGTGGTGATGGTGAC(HindIII)，經過PCR擴增后，產物用DNA瓊脂糖凝膠檢測，切膠回收目的基因片段。將目的基因片段和穿梭載體pAdTrack-CMV用BglII和HindIII限制性內切酶雙酶切，通過T4連接酶連接得到pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體。用BglII和HindIII雙酶切驗證以及測序驗證穿梭載體的正確性。用PmeI酶將pAdTrack-CMV-FSH/His穿梭載體線性化，切膠回收載體，將其轉化到含有pAdEasy-1骨架載體的BJ5183感受態(tài)，在含卡那霉素的LB平板上過夜生長。挑取平板上較小的菌落，擴大培養(yǎng)后，提取質粒，并用PacI酶切驗證目的基因是否與骨架載體重組得到腺病毒載體pAdEasy-FSH/His，同時測序驗證重組腺病毒載體的正確性。

1.2.2 重組腺病毒的包裝、擴增與滴度測定 將HEK 293A細胞復蘇后傳代到25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，確保24 h后細胞匯合度為50%左右，將已經測序正確的線性化腺病毒表達載體pAdEasy-FSH/His和脂質體Lipofectamine 2000按照1:3(3 μg質粒：9 μL脂質體)的比例轉染HEK 293A，轉染4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。轉染3 d后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白的表達，每2～3 d添加少量新鮮培養(yǎng)基。到10～14 d后，細胞幾乎全部可以觀察到熒光，并且細胞呈葡萄球狀且大量漂起，此時可收集第一代病毒。用第一代病毒感染HEK 293A細胞，擴增后收集第二代病毒，如此反復，收集得到第三代腺病毒，用LaSRT法測定第三代腺病毒滴度。

1.2.3 重組人FSH腺病毒感染GMEC細胞 感染前確定腺病毒感染的最佳MOI值，將實驗室凍存的GMEC細胞復蘇，在DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%FBS)、37 ℃和5% CO2下經過傳代培養(yǎng)后，按1×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別用MOI值為60、100、140、180、220、260的重組腺病毒感染乳腺上皮細胞，每個組設置3個重復，2 h后換新鮮的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后觀察GFP熒光情況和細胞病變狀況，選擇轉染效率高且病變作用小的作為最佳感染復數(shù)。用最佳感染復數(shù)感染GMEC細胞48 h后，收集活細胞蛋白。

1.2.4 Western blot鑒定rhFSH在GMEC的表達 制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，進行SDS-PAGE(蛋白樣品15 μL，非還原上樣緩沖液，濃縮膠80 V，分離膠100 V)；將蛋白從凝膠轉移到PVDF膜上，4 ℃下用5%的脫脂奶粉過夜封閉；將PVDF膜置于TBST緩沖液配置的抗FSH多克隆抗體中，4 ℃過夜孵育；TBST洗膜4次，每次10 min；用羊抗兔HRP酶標二抗在4 ℃下孵育4 h；TBST洗膜4次，每次10 min；用ECL化學發(fā)光液顯色后在化學發(fā)光成像儀中曝光，觀察目的蛋白的表達情況。

1.2.5 rhFSH重組蛋白的純化 將含金屬Ni的瓊脂糖填料混勻后裝入層析柱，排出柱中乙醇，用10倍柱體積的上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 咪唑，0.5 mmol/L NaCl)平衡鎳柱。樣品過柱完成后，用洗雜緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl)沖洗去部分雜蛋白。用適量洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl)將鎳柱上的目的蛋白洗脫下來并進行SDS-PAGE鑒定。

1.2.6 體外驗證rhFSH的生物學功能 將實驗室建立并且保存的人卵泡刺激素受體(FSHR)基因的穩(wěn)定細胞株HEK-293-FSHR進行復蘇，按照2×104個細胞/孔的密度種到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入0.1 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，培養(yǎng)24 h。將純化的rhFSH蛋白作為試驗組、Gonal-F作為陽性對照組，分別用培養(yǎng)基稀釋后加入到細胞中，空白組細胞只加等體積的完全培養(yǎng)基，每個組設3個復孔，培養(yǎng)1h，裂解細胞后用cAMP試劑盒檢測細胞cAMP的含量。

2 結果與分析

2.1 重組人FSH腺病毒載體的構建與鑒定

以pIRES-FSH-neo3為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠檢測結果見圖1A 。擴增片段約820 bp，大小與人FSH一致。回收目的基因片段，經過BglⅡ和HindⅢ雙酶切后與pAdTrack-CMV連接，產物經酶切及瓊脂糖凝膠電泳，獲得了約9 100 bp的穿梭載體及約820 bp的目的基因條帶(圖1B)，穿梭載體pAdTrack-CMV-FSH/His構建成功。將pAdTrack-CMV-FSH/His用PmeⅠ酶切后轉化含pAdEasy-1骨架載體的BJ5183大腸桿菌感受態(tài)，挑取4個單克隆菌落，擴大培養(yǎng)后提取質粒，發(fā)現(xiàn)有2個菌落中提取的質粒與穿梭載體條帶不同，可能是重組后的腺病毒載體。以這2個質粒為模板進一步用PCR檢測發(fā)現(xiàn)2個質粒中都可以獲得大小約820 bp的目的基因條帶(圖2)，說明成功構建了pAdEasy-FSH/His腺病毒表達載體。

2.2 重組人FSH腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

將重組腺病毒載體用PacI酶線性化后用Lipofectamine 2000轉染到HEK 293A細胞中，3 d后在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達，6 d后綠色熒光表達量明顯增加，9 d后細胞出現(xiàn)大量彗星狀綠色熒光，13 d時有50%細胞從培養(yǎng)瓶底脫落，細胞成葡萄球形狀，此時可以收集P1代病毒，細胞感染腺病毒效果如圖3所示。用第一代病毒繼續(xù)感染HEK 293A細胞得到第二代和第三代腺病毒，第三代腺病毒具有較高的病毒滴度，可以用來感染GMEC細胞細胞。用LaSRT法測定測定第三代病毒滴度，如圖4所示，隨著孔數(shù)的增加，綠色熒光逐漸變暗，即隨著病毒濃度的降低，熒光逐漸減少。重組腺病毒在第8個孔時，綠色熒光數(shù)不足5個，并且在第9個孔后完全黑暗，因此計算病毒滴度為1×109PFU/mL。

2.3 重組人FSH腺病毒感染GMEC細胞及其表達rhFSH的鑒定

用得到的第三代腺病毒感染GMEC細胞，經過觀察GFP熒光表達量以及細胞的病變程度發(fā)現(xiàn)，當重組人FSH腺病毒感染復數(shù)為180時，細胞未出現(xiàn)明顯病變且綠色熒光表達量較多，效果最好，滿足后續(xù)試驗要求。用最佳感染復數(shù)感染GMEC細胞48 h后，明顯能夠觀察到綠色熒光蛋白的大量表達(圖5)。收集經過腺病毒感染與未被腺病毒感染的活細胞蛋白，通過Western blotting鑒定后，發(fā)現(xiàn)經過重組FSH腺病毒感染的GMEC細胞蛋白在大約40 kDa大小的地方有明顯條帶出現(xiàn)，未經過腺病毒感染的GMEC細胞蛋白在同樣的位置未見條帶出現(xiàn)，結果表明人FSH目的基因成功在GMEC細胞中表達(圖6)。

2.4 rhFSH重組蛋白的純化

用鎳柱純化GMEC細胞表達的重組蛋白，經SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色，結果見圖7，得到大小在40 kDa左右的蛋白條帶，與2.3結果中目的蛋白大小結果一致，表明用鎳柱成功純化得到了rhFSH蛋白，為下一步鑒定蛋白體外生物活性奠定基礎。

2.5 體外驗證rhFSH的生物學功能cAMP

FSH受體(FSHR)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，F(xiàn)SH激活FSHR后，F(xiàn)SHR誘導細胞合成cAMP。在細胞培養(yǎng)基中添加了GMEC細胞表達的rhFSH及陽性對照Gonal-F后，若FSH具備活性，穩(wěn)定表達FSHR的HEK 293A細胞內會產生cAMP，通過裂解細胞，用cAMP檢測試劑盒檢測細胞裂解液中的含量可以表明FSH的生物學功能。圖8中結果表明，培養(yǎng)基中添加了GMEC細胞表達的rhFSH和陽性對照Gonal-F兩個組誘導HEK 293-FSHR細胞產生的cAMP與空白對照組比差異極顯著(P<0.01)，這說明GMEC細胞表達的rhFSH具備和商品化的基因工程產品Gonal-F一樣的體外生物活性。

3 討 論

人卵泡刺激素是由腦垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，它是由FSHα亞基蛋白以及FSHβ亞基蛋白通過非共價鍵結合組成的異源二聚體糖蛋白[9-11]。目前FSH在臨床上主要用于輔助生殖，治療不孕不育，市場潛力巨大[12-13]。卵泡刺激素有腦垂體來源FSH、尿源FSH以及基因重組FSH。腦垂體FSH由于腦垂體來源少、不易獲得，價格昂貴，所能提取到的FSH純度不高以及其他的一些毒副作用等缺點，使得垂體FSH無法被市場廣泛應用而退出市場[14]。而尿源FSH是從絕經期婦女的尿液里面提取的，早期工藝比較落后時，尿源FSH里面含的大量促黃體素(LH)及其他的雜蛋白會給治療效果帶來很大影響?；蛑亟MFSH有著純度高、安全性高、活性高和來源均一等優(yōu)勢[15]。由于FSH的糖基化過程對于其生物活性有非常重要的作用，因此需要通過真核表達系統(tǒng)表達重組FSH[16]。目前已經報導的用于基因工程制備重組FSH的表達系統(tǒng)主要有中國倉鼠卵巢細胞、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞等表達系統(tǒng)[17-19]。本研究利用哺乳動物細胞GMEC表達rhFSH蛋白，GMEC細胞和中國倉鼠卵巢細胞、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞等表達系統(tǒng)一樣具備糖基化功能，經過體外活性試驗驗證GMEC表達的rhFSH和目前上市的Gonal-F一樣具備良好的體外生物活性。

GMEC細胞與中國倉鼠卵巢細胞等不同，較難轉染，因此選擇一種高效的轉染體系對于在GMEC細胞表達rhFSH尤為重要。腺病毒表達體系具有宿主范圍廣、致病性低、表達效率高、不受細胞是否分裂的影響、操作簡便且病毒滴度高等優(yōu)點[20]。并且目前還沒有以腺病毒感染動物乳腺細胞制備FSH的研究報導。本研究采用了腺病毒轉染GMEC細胞來獲取rhFSH蛋白，通過構建重組人FSH腺病毒載體在HEK-293A細胞中包裝得到重組人FSH腺病毒，重組人FSH腺病毒感染GMEC細胞后在細胞培養(yǎng)上清以及細胞質中獲取了大量可溶的rhFSH，這為下一步獲取純度較高的rhFSH用于體外活性檢測奠定基礎，這也表明了GMEC細胞具備良好的分泌外源rhFSH蛋白的潛力。

相比細胞工程制備重組蛋白藥物，如今利用乳腺生物反應器制備重組蛋白藥物是較為熱門的研究方向，這種方法和細胞工程方法制備FSH相比具有產量高、價格低的優(yōu)勢，不過目前相關方面的研究報道較少，只有少數(shù)在小鼠和兔子這類小動物乳腺中制備得到具備生物活性的重組FSH的研究報導[8,21]，這說明通過大動物乳腺制備重組FSH是可行的。為了探索將來進一步利用大動物生產人FSH蛋白藥物，本研究選擇山羊乳腺組織行使泌乳功能的GMEC細胞作為表達rhFSH的系統(tǒng)，構建了腺病毒表達載體包裝得到重組人FSH腺病毒，在體外感染GMEC細胞后制備了大量的rhFSH蛋白，并驗證了rhFSH蛋白具備體外生物活性，在體外細胞層面驗證了大動物乳腺制備rhFSH的可行性，這為大動物乳腺制備rhFSH奠定了良好的研究基礎。

4 結 論

本研究通過構建人FSH基因腺病毒表達載體，利用羊乳腺上皮細胞(GMEC)表達人FSH基因，經過Western blotting檢測GMEC細胞可以成功表達rhFSH蛋白。GMEC細胞表達的rhFSH經過純化后通過體外生物活性驗證后發(fā)現(xiàn)其具備Gonal-F同樣的體外生物功能，這為大動物乳腺制備人FSH奠定了前期的研究基礎。