程 潔 張 棟 李 娟 閆桂艷 谷建琦

顳頜關(guān)節(jié)紊亂病是口腔科臨床的常見病、多發(fā)病，以關(guān)節(jié)彈響、疼痛、張口受限為主要臨床癥狀。本研究造模大鼠單側(cè)咀嚼模型，導(dǎo)致雙側(cè)髁突受力不均，髁突軟骨發(fā)生生理性及病理性改建。終身具有改建能力是髁突軟骨的重要生物學(xué)特征，因此短暫的咬合關(guān)系異常可能不會(huì)對(duì)顳頜關(guān)節(jié)造成實(shí)質(zhì)性的破壞，但長期單側(cè)咀嚼帶來的受力不均則可能導(dǎo)致顳頜關(guān)節(jié)紊亂病的發(fā)生，造成顳頜關(guān)節(jié)系統(tǒng)不可逆的改變。本研究通過檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)一步探討髁突軟骨細(xì)胞的凋亡機(jī)制及相關(guān)蛋白的相互作用關(guān)系。

資料和方法

選取由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供的3 周齡雄性SD 大鼠（3 周齡，體重160g～190g）96 只，隨機(jī)等量分為8 組，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各4 組，每組12 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，拔除左側(cè)上、下頜所有磨牙，于拔牙后第1d、7d、14d、28d 取材。

動(dòng)物造模及取材：實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛4ml/kg 腹腔注射麻醉后，拔除左側(cè)上、下頜所有磨牙，對(duì)照組不做任何處理。拔牙后第1d、7d、14d、28d，每組隨機(jī)選取6 只，完整取出雙側(cè)髁突關(guān)節(jié)軟骨，于多聚甲醛中固定。另外6 只，麻醉后直接取髁突軟骨凍存于-80℃冰箱中。對(duì)照組大鼠與對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組同期處死并取材。

免疫組化染色：常規(guī)固定、包埋，將厚度4um 的組織切片脫蠟、入水后，3%甲醇雙氧水，室溫30 分鐘，自來水洗，采用熱修復(fù)方法之后放入PBS 中，然后進(jìn)行劃蠟；切片上滴加山羊血清封閉液，室溫30分鐘；滴加第一抗體，4℃過夜，次日拿出來后等10～20 分鐘室溫平衡后放入PBS 中；滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃20 分鐘，放入PBS 中；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20分鐘，放入PBS 中；DAB 顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核7～8S，脫水，二甲苯透明、中性樹脂封片。顯微鏡下觀察，使用美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus v 5.1 軟件進(jìn)行圖像分析。

實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)：用Trizol 提取組織樣本中總RNA。取5μlRNA 用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA 的完整性。用天根生物科技有限公司的TIANScript RT KIT 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin 用作內(nèi)定參考。PCR 反應(yīng)程序：95℃15min，95℃10s，58℃30s，72℃30s，循環(huán)40 次。分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60℃～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

用熒光定量PCR 儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。根據(jù)RT-PCR 原始檢測(cè)結(jié)果，按照2-△△ct相對(duì)定量計(jì)算公式，即：△△Ct＝[Ct目的基因（實(shí)驗(yàn)組）-CtBeta基因（實(shí)驗(yàn)組）]-[Ct目的基因（對(duì)照組）-CtBeta基因（對(duì)照組）]。計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品目的基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的差異。

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)及對(duì)照組之間的比較，各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)同側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)分析均采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.免疫組化結(jié)果：鏡下選取5 個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度，從而得出免疫組化評(píng)分（IHS）的數(shù)值。caspase-12 在髁突軟骨細(xì)胞中的DAB 顯色為棕黃色，對(duì)照組陽性表達(dá)很少，陽性細(xì)胞主要位于肥大層（圖1）。實(shí)驗(yàn)組左側(cè)IHS 評(píng)分1d，7d，14d，28d 時(shí)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），陽性細(xì)胞分布于增殖層和肥大層；實(shí)驗(yàn)組右側(cè)IHS 評(píng)分1d，7d，14d 時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），28d 時(shí)與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。1d、7d、14d、28d組，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)IHS 評(píng)分逐漸升高，14d 較7d 組、28d 較14d 組升高有顯著性差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組右側(cè)IHS 評(píng)分逐漸降低，在7d，28d 時(shí)降低較前一時(shí)間點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），28d 時(shí)與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖1 對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組左側(cè)及實(shí)驗(yàn)組右側(cè)染色結(jié)果比較（免疫組化染色 ×400）

圖2 不同時(shí)間IHS 評(píng)分對(duì)比

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)p53 含量在不同時(shí)間段的變化

表2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)Bcl-2 含量在不同時(shí)間段的變化

2.RT-PCR 結(jié)果：由于對(duì)照組p53 和Bcl-2 含量在不同時(shí)間點(diǎn)的左右側(cè)對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），所以分別將不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組的左、右側(cè)合并為一組。拔牙后1d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組右側(cè)p53 含量＞實(shí)驗(yàn)組左側(cè)＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Bcl-2 含量實(shí)驗(yàn)組左側(cè)和右側(cè)均高于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)高于實(shí)驗(yàn)組右側(cè)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。拔牙后7d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組左、右側(cè)均高于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組左側(cè)高于實(shí)驗(yàn)組右側(cè)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；Bcl-2 含量實(shí)驗(yàn)組左側(cè)和右側(cè)均高于對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)高于實(shí)驗(yàn)組左側(cè)（P＞0.05）。拔牙后14d 時(shí)，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)p53含量＞實(shí)驗(yàn)組右側(cè)＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Bcl-2 含量實(shí)驗(yàn)組右側(cè)＞實(shí)驗(yàn)組左側(cè)＞對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。拔牙后28d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)p53 含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組右側(cè)和對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Bcl-2 含量實(shí)驗(yàn)組左側(cè)明顯低于實(shí)驗(yàn)組右側(cè)和對(duì)照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組右側(cè)與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨時(shí)間延長縱向比較，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)p53 含量1d、7d、14d、28d 逐漸升高的趨勢(shì)，14d 組較7d 組顯著升高（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著升高（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組右側(cè)p53 含量逐漸降低的趨勢(shì)，14d 組較7d組顯著降低（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著降低（P＜0.05）。Bcl-2 在實(shí)驗(yàn)組左側(cè)的表達(dá)逐漸降低，14d 組較7d 組顯著降低（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著降低（P＜0.05）；Bcl-2 在實(shí)驗(yàn)組右側(cè)的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，14d 組較7d 組顯著增強(qiáng)（P＜0.05），28d 組較14d 組顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。

討 論

顳頜關(guān)節(jié)紊亂病以髁突的病理性改變?yōu)橹饕±韺W(xué)特征，許多學(xué)者對(duì)各種外界刺激導(dǎo)致的髁突軟骨的退行性改變做了大量研究[1～4]。本研究對(duì)單側(cè)拔牙后，大鼠雙側(cè)髁突承受壓力失衡導(dǎo)致的髁突軟骨細(xì)胞的退行性改變進(jìn)行相關(guān)凋亡通路中關(guān)鍵蛋白的檢測(cè)，了解髁突軟骨細(xì)胞的凋亡途徑。

p53 蛋白主要分布于細(xì)胞核漿，由于p53 蛋白易降解，因此正常細(xì)胞中p53 的蛋白水平較低。p53可整合多種壓力刺激信號(hào)并隨之影響細(xì)胞[5]。氧化應(yīng)激反應(yīng)下，細(xì)胞DNA 受損時(shí)，p53 的表達(dá)上調(diào)，阻止DNA 復(fù)制，為DNA 修復(fù)創(chuàng)造條件，若DNA 修復(fù)失敗，則引發(fā)細(xì)胞凋亡反應(yīng)[12]。p53 蛋白受到多種調(diào)控因子的作用[6，7，11]。p53 通過激活其下游的p21 WAF1/CIP1 基因介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Bcl-2（B-cell lymphoma-2），屬膜整合蛋白，位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、連續(xù)的核周膜，有促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡的作用[8]。Bcl-2 可阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C，發(fā)揮抗凋亡作用；而Bax 通過與線粒體上離子通道的相互作用可介導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放，促進(jìn)凋亡[8，9]。p53 可通過增加Bax 的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。p53 通過對(duì)Bcl-2 的基因轉(zhuǎn)錄抑制或蛋白修飾來拮抗Bcl-2 的功能，p53 也可直接抑制Bcl-2 的功能。也有研究表明p53 可與Bcl-2 直接結(jié)合，抑制Bcl-2 的功能[10]。

caspase-12 屬于caspase 家族，是一類半胱氨酸蛋白酶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白。細(xì)胞受到氧化應(yīng)激反應(yīng)后發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生蛋白錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白增多，激活caspase-12，經(jīng)過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終由caspase-3 執(zhí)行細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。許多學(xué)者對(duì)caspase-12 在髁突軟骨中的作用也做了大量研究，發(fā)現(xiàn)caspase-12 參與了髁突軟骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡反應(yīng)[13～15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠拔除左側(cè)磨牙后，導(dǎo)致咬合關(guān)系的突然改變，進(jìn)而致雙側(cè)髁突受力發(fā)生改變，髁突軟骨細(xì)胞受到力學(xué)系統(tǒng)改變激發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。左側(cè)咀嚼壓力突然降低，且拔牙后的炎癥反應(yīng)引起細(xì)胞DNA 損傷，RT-RCR 結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組左側(cè)p53 的表達(dá)上調(diào)，較對(duì)照組增加有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組右側(cè)由于咀嚼壓力的突然增大，也導(dǎo)致髁突軟骨細(xì)胞中p53 含量增加明顯。p53 的上調(diào)導(dǎo)致Bcl-2的表達(dá)下降，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)和右側(cè)的軟骨細(xì)胞中Bcl-2 含量逐漸降低。驟然增加的咀嚼壓力導(dǎo)致髁突軟骨細(xì)胞胞漿中的Ca+濃度增加，多余的Ca+被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca+超載導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生超負(fù)荷反應(yīng)，進(jìn)而使caspase-12 增加。免疫化染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組左側(cè)的caspase-12 逐漸增加，且14d 較7d 組、28d 較14d 組增加有顯著性差異，這與RT-RCR 的結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了以上反應(yīng)機(jī)制。組織學(xué)變化顯示實(shí)驗(yàn)組右側(cè)1d、7d、14d 組的免疫組化染色caspase-12 的HIS 評(píng)分增加，即肥大層的棕黃色染色細(xì)胞增加，說明p53 激活p21 WAF1/CIP1 進(jìn)一步發(fā)生凋亡反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的關(guān)鍵蛋白caspase-12 表達(dá)增加，進(jìn)一步激活caspase-9，最終由caspase-3 執(zhí)行凋亡反應(yīng)。隨時(shí)間延長，右側(cè)髁突對(duì)新的壓力逐漸適應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組右側(cè)caspase-12 的HIS 評(píng)分減少至與對(duì)照組無顯著性差異，表明隨著軟骨細(xì)胞內(nèi)DNA 修復(fù)的進(jìn)行，右側(cè)p53 逐漸下調(diào)，而抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2 表達(dá)逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡被抑制，caspase-12 表達(dá)也逐漸降低，組織逐漸恢復(fù)正常，而左側(cè)髁突缺乏正常的咀嚼壓力刺激，發(fā)生廢用性萎縮，實(shí)驗(yàn)組左側(cè)的p53 含量逐漸增高，Bcl-2 受抑制呈下降趨勢(shì)。可見單側(cè)后牙缺失導(dǎo)致的雙側(cè)髁突軟骨受力不平衡，初期雙側(cè)髁突軟骨均出現(xiàn)病理性改變，誘導(dǎo)促凋亡蛋白表現(xiàn)出p53、caspase-12 表達(dá)增強(qiáng)，抗凋亡蛋白Bcl-2 含量降低，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡反應(yīng)，隨時(shí)間延長，右側(cè)髁突逐漸適應(yīng)新的外力負(fù)荷，p53、caspase-12 表達(dá)下降，細(xì)胞增殖與凋亡反應(yīng)逐漸恢復(fù)平衡。本研究采用了免疫組化和RT-PCR 兩種檢測(cè)方法，通過免疫組化，我們可以定位檢測(cè)蛋白質(zhì)，陽性的強(qiáng)弱表示量的多少，也就是它與配體或抗體的結(jié)合的量；RT-PCR 實(shí)質(zhì)上是對(duì)mRNA 的擴(kuò)增，可據(jù)此分析某一特異基因在組織細(xì)胞中的表達(dá)情況，用作基因的定量測(cè)量，這兩種檢測(cè)方法結(jié)合，更加全面地分析了蛋白質(zhì)的產(chǎn)生地和產(chǎn)生能力。