關(guān)樺楠，吳巧艷，彭 勃，薛 悅，孫 璐，遲德富，張 娜

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076 2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

近年來(lái)，重金屬污染已成為影響環(huán)境、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略問(wèn)題之一，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[1-4]。雖然自然環(huán)境中的重金屬離子濃度處于微量水平，但它們可以通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)積累到高濃度，當(dāng)攝入超過(guò)閾值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致人類出現(xiàn)嚴(yán)重的健康紊亂狀況[5]。目前，重金屬殘留常規(guī)的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、光譜法、酶分析法、免疫分析法[6-10]等，然而，這些方法都有價(jià)格昂貴、儀器沉重和不易攜帶等諸多缺點(diǎn)。電化學(xué)檢測(cè)方法具有成本低、響應(yīng)快、簡(jiǎn)單、靈敏度高、小型化等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為許多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

電化學(xué)酶生物傳感器因其簡(jiǎn)單性、靈敏性、選擇性和低成本而備受關(guān)注[11]。但由于受到酶活性及穩(wěn)定性的影響，導(dǎo)致酶生物傳感器的應(yīng)用受到限制，因此，將脂質(zhì)體作為酶的載體引入其中，能有效保持酶的活性和提高酶抑制反應(yīng)的穩(wěn)定性，可解決此類問(wèn)題。此外，金納米粒子(AuNPs)因具有特殊的性質(zhì)[12]，如離子共振特性[13]、金納米熒光特性[14]、電化學(xué)特性[15]、吸附特性[16]和分子識(shí)別特性[17]等，可通過(guò)其修飾工作電極以增強(qiáng)電極的靈敏度，提高響應(yīng)信號(hào)和空白的比值[18-20]。

作者采用薄膜蒸發(fā)-凍融聯(lián)用法構(gòu)建具有“細(xì)胞”通透結(jié)構(gòu)的半封閉的葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體反應(yīng)器，用以提升葡萄糖氧化酶(GOD)的穩(wěn)定性；利用自組裝技術(shù)將金納米粒子與葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體(GLM)反應(yīng)器共修飾于玻碳電極表面，以期構(gòu)建新型的用于檢測(cè)重金屬殘留(Hg2+和Cu2+)的葡萄糖氧化酶電化學(xué)生物傳感器。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖氧化酶(100 U/mg)、魚(yú)精蛋白、大豆卵磷脂和膽固醇：Sigma-Ameresco公司；石墨粉：哈爾濱賽拓生物公司；高錳酸鉀：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、濃磷酸、水合肼、氯化汞、硫酸銅、丙酮：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鐵氰化鉀：天津市北辰方正試劑廠。

CJJ79-1型磁力加熱攪拌器：常州越新儀器制造有限公司；LK98電化學(xué)工作站：天津蘭力科化學(xué)電子有限公司；JK-100型超聲波清洗器：西安常儀儀器設(shè)備有限公司；JSM-6460LV SEM掃描電子顯微鏡：日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 金納米粒子的制備及表征

采用硼氫化鈉法制備金納米粒子。取20 mL去離子水于冰箱中預(yù)冷，之后加入0.5 mL 的1%的氯金酸溶液，再加入0.1 mL的Na2CO3溶液(0.2 mol/L)。將磁力攪拌器攪拌速度調(diào)至快速，分3次加入新配置的0.5 mL的0.5 mg/mL硼氫化鈉溶液中，直至溶液顏色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)攪拌10 min后，結(jié)束反應(yīng)。獲得的金納米粒子溶液4 ℃保存于棕色瓶中備用。

1.2.2 葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體(GLM)的制備與表征

稱取帶負(fù)電的大豆卵磷脂0.5 g、膽固醇0.1 g和GOD粉末15 g，將3種物質(zhì)共溶于10 mL的二氯甲烷中，再準(zhǔn)確加入0.1 mL吐溫20。將上述體系移至茄形燒瓶中，置于37 ℃水浴鍋內(nèi)，調(diào)節(jié)蒸發(fā)儀的旋轉(zhuǎn)速度，利用減壓蒸餾法完全蒸出二氯甲烷，在茄形燒瓶的內(nèi)壁出現(xiàn)一層均勻的薄膜時(shí)，加入配置好的葡萄糖溶液5 mL，持續(xù)旋轉(zhuǎn)30 min，得到懸浮液。采用微孔濾膜器除去雜質(zhì)，將獲得的濾液放入液氮中停留1 min，隨后立即放入37 ℃水浴鍋內(nèi)，待融化后放入液氮中再次冷凍，重復(fù)冷凍融化多次后，將溶液在室溫下放置10 min。然后離心5 min (10 000 r/min)，舍棄上清液。反復(fù)操作5次，過(guò)濾后經(jīng)過(guò)冷凍干燥，最終得到粉末狀脂質(zhì)體(GLM)，4 ℃下封閉保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 電化學(xué)響應(yīng)性能研究

利用電化學(xué)工作站中的3種不同的電極，將玻碳電極作為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極，將與玻碳電極同等直徑大小的乙酸纖維素膜圓片固定在電極表面，利用乙酸配制0.5 mg/mL的殼聚糖溶液，調(diào)節(jié) pH值為5.0，將電極浸泡其中，于-0.3 V恒定電位條件下，電沉積3 min。取下酸纖維素膜置于紅外燈下烘干，再用去離子水反復(fù)清洗電極及環(huán)形塑料蓋，干燥后重新將膜(帶正電荷)固定在電極表面。利用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)配制1 mg/L的GLM懸浮液，取1 mL與8 mL金納米溶液均勻混合，緩慢滴涂于乙酸纖維素膜上，氮?dú)獯蹈桑? ℃干燥保存(不超過(guò)1 d)，即得由金納米粒子修飾的酶脂質(zhì)體電極。將連接好的電極置于盛有10 mL磷酸鹽緩沖溶液的燒杯中，放在恒溫磁力攪拌器臺(tái)面上，調(diào)節(jié)溫度為37 ℃，加入2 mL的葡萄糖溶液(1 mol/L)，反應(yīng)時(shí)間為10 min。采用循環(huán)伏安(CV)法，考察電極修飾前后電流響應(yīng)性能的變化，以未經(jīng)過(guò)修飾的酶脂質(zhì)體電極作為對(duì)照，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2.4 金納米修飾酶脂質(zhì)體生物傳感器對(duì)重金屬離子Hg2+和Cu2+的檢測(cè)

將連接好的電極置于盛有10 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.6)的燒杯中，調(diào)節(jié)磁力攪拌器速度，當(dāng)CV曲線穩(wěn)定后，分別加入0.1 mL不同濃度(10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-10mol/L)的重金屬離子(Hg2+和Cu2+)溶液，攪拌均勻，加入2 mL葡萄糖溶液(0.1 mol/L)，繼續(xù)攪拌30 min后，進(jìn)行曲線掃描檢測(cè)電流響應(yīng)情況。根據(jù)重金屬離子濃度的不同，觀察不同的電流變化，繪制抑制率-濃度對(duì)數(shù)擬合曲線，并計(jì)算最低檢出限。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，抑制率計(jì)算公式如下[21-22]：

式中：I為抑制率(%)；I0為氧化峰電流(體系無(wú)添加重金屬離子)；I1為氧化峰電流(添加重金屬離子)。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米粒子的表征

選擇硼氫化鈉還原法制備金納米粒子，對(duì)其進(jìn)行紫外-可見(jiàn)吸收光譜法分析，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，在波長(zhǎng)527 nm處具有明顯的吸收峰，這是由于紫外-可見(jiàn)光譜對(duì)高度分散狀態(tài)和以締合狀態(tài)存在的金屬顆粒有著顯著差異的響應(yīng)信號(hào)。根據(jù)Mie理論可知，金納米粒子在波長(zhǎng)520 nm左右出現(xiàn)吸收峰時(shí)粒徑為3～20 nm。因此，可初步認(rèn)為所制備的金納米粒子的粒徑約為25 nm。

圖1 金納米粒子的紫外-可見(jiàn)光吸收光譜Fig.1 UV-Vis spectrum of gold nanoparticles

利用透射電子掃描電鏡(TEM)觀察所制備的金納米粒子的表觀形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，金納米粒子整體呈規(guī)則的圓球型，均勻分布其中，平均粒徑大小約為27 nm，且沒(méi)有成團(tuán)出現(xiàn)，說(shuō)明具有良好的單分散性能。綜上所述，基于硼氫化鈉還原法成功制備出金納米粒子，它是一種良好的修飾材料。

圖2 金納米粒子的透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron micrograph of gold nanoparticles

2.2 GOD脂質(zhì)體的表征

圖3 脂質(zhì)體掃描電子顯微鏡圖Fig.3 Scanning electron micrograph of liposomes

利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察所制備的GLM的表觀形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，GLM整體呈規(guī)則的球型，表面完整，且無(wú)明顯的聚集現(xiàn)象，平均直徑為4～8 μm。由于膠囊壁的彈性作用，脂質(zhì)體之間表現(xiàn)出相互擠壓的狀態(tài)。動(dòng)態(tài)光散射粒度儀(DLS)分析證實(shí)，該脂質(zhì)體的平均直徑為(5.83±0.75) μm。若按體積計(jì)算，78%的脂質(zhì)體的直徑均低于8 μm，且大部分的懸浮液主要集中在3～12 μm。

2.3 金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng)

考察金納米粒子修飾電極前后，在相同的條件下(詳見(jiàn)1.2.3)電極電流響應(yīng)性能的變化。由圖4可以看出，采用用金納米粒子修飾過(guò)的酶脂質(zhì)體電極所構(gòu)建的葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鞯难趸€原電流相對(duì)較大，這是由于金納米粒子修飾過(guò)酶脂質(zhì)體電極后，使得電極表面有效面積顯著增加，且金納米粒子具有良好的電信號(hào)傳導(dǎo)性能，增加了電極表面電子的傳遞速度，有效地提高了整個(gè)體系中的反應(yīng)活躍程度[20]。雖然氧化峰的電位在0.57 V時(shí)出現(xiàn)微小波動(dòng)，但未對(duì)整體造成較大影響。綜上所述，經(jīng)金納米粒子修飾的酶脂質(zhì)體電極靈敏度更高。

圖4 電極修飾前后的電流響應(yīng)性能對(duì)比Fig.4 Comparison of current response performance before and after electrode modification

2.4 金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)重金屬離子研究

2.4.1 金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)Hg2+和Cu2+

金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體生物傳感器檢測(cè)Hg2+和Cu2+的濃度的原理為重金屬離子對(duì)葡萄糖氧化酶的酶促反應(yīng)有特異性抑制作用，從而使得酶促反應(yīng)的電流響應(yīng)信號(hào)變?nèi)?，進(jìn)而推算出體系中重金屬殘留的濃度[22]。將葡萄糖氧化酶進(jìn)行脂質(zhì)體包埋，隔絕外界環(huán)境對(duì)酶抑制反應(yīng)的干擾，可以提高反應(yīng)的穩(wěn)定性，增強(qiáng)電流變化的響應(yīng)性能。由圖5可知，兩種重金屬離子均出現(xiàn)較明顯的氧化峰峰型，且隨著體系中Hg2+和Cu2+濃度的不斷減小，氧化峰電流絕對(duì)值卻不斷增大，說(shuō)明隨著溶液中重金屬離子濃度的增大，酶脂質(zhì)體電極對(duì)Hg2+和Cu2+的富集作用越來(lái)越接近飽和狀態(tài)，葡萄糖氧化酶的活性不斷降低，體系中的氧化還原反應(yīng)受到抑制，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫不斷減少，造成整個(gè)體系中的電子轉(zhuǎn)移量減少，氧化峰電流絕對(duì)值的降低，證明此方法具有較高的檢測(cè)靈敏度，更適合微量檢測(cè)。但在檢測(cè)過(guò)程中，兩種重金屬離子的氧化峰峰谷出現(xiàn)在不同的電位下，即Hg2+在氧化峰電位為0.15 V處，Cu2+在氧化峰電位為0.20 V處。因此，根據(jù)氧化峰出峰位置的不同，可直接用以區(qū)分Hg2+和Cu2+。

2.4.2 最低檢出限、抑制率及擬合曲線的繪制

通過(guò)計(jì)算抑制率，以重金屬離子濃度的對(duì)數(shù)作為變量，繪制擬合曲線，結(jié)果如圖6所示。

圖6 Hg2+和Cu2+不同濃度對(duì)數(shù)校正擬合曲線Fig.6 Calibrated fitting curves for Hg2+ and Cu2+with different concentrations

由圖6可以看出，在10-6～10-2mmol/L濃度之間，Hg2+的擬合線性方程為I=0.042 3lgC+ 0.583 6，R2=0.986 3，最低檢出限為4.38 ng/mL，方程具有良好的線性關(guān)系；在10-8～10-4mmol/L濃度之間，Cu2+的擬合方程為I=0.066lgC+0.632 3，R2=0.994 9，最低檢出限為6.52 ng/mL，同樣具有良好的線性關(guān)系。利用該方法所獲得的最低檢出限，均顯著低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(汞殘留10 μg/mL，銅殘留2 mg/mL)，綜上所述，基于金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體構(gòu)建生物傳感器檢測(cè)Hg2+和Cu2+濃度的方法具有良好的靈敏度。

3 結(jié)論

基于葡萄糖氧化酶脂質(zhì)體反應(yīng)器，并利用金納米粒子自組裝技術(shù)修飾工作電極，構(gòu)建用于快速檢測(cè)Hg2+和Cu2+的濃度葡萄糖氧化酶電化學(xué)生物傳感器。該類型生物傳感器在引入脂質(zhì)體確保酶抑制反應(yīng)不受外界環(huán)境干擾的前提下，通過(guò)金納米粒子修飾酶脂質(zhì)體電極有效地增強(qiáng)了電極的靈敏度。研究結(jié)果表明，在實(shí)際檢測(cè)Hg2+和Cu2+的濃度時(shí)，該傳感器表現(xiàn)出了良好的靈敏度。本研究將為重金屬殘留快速檢測(cè)方法的改良提供新的方向。