錢玉霞，邱衛(wèi)華，任 虹*

(1.北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 中國輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048;2.中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190;3.中國科學(xué)院潔凈能源創(chuàng)新研究院，遼寧 大連 116023)

將低值化的木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)變成制備高值化產(chǎn)品的原料，首先需要突破抵御生物和酶攻擊的天然屏障，構(gòu)建高濃度的“糖平臺(tái)”[1-3]。預(yù)處理技術(shù)可以打破木質(zhì)纖維素原料的致密結(jié)構(gòu)，增大其表面孔徑和比表面積，從而提高原料的纖維素酶(Cel)水解效率及后續(xù)微生物的多糖利用率。水熱預(yù)處理(hot-water pretreatment，HWP)因無需添加任何化學(xué)試劑即可高效去除大量半纖維素和部分木質(zhì)素等，被認(rèn)為是一種低成本的綠色預(yù)處理方法[4-5]。然而，水熱預(yù)處理對(duì)原料中木質(zhì)素的降解能力較弱。由于殘留的木質(zhì)素可能會(huì)形成物理屏障，導(dǎo)致酶的非生產(chǎn)性吸附，從而影響后續(xù)的酶水解效率[6-7]。真菌，尤其是白腐菌，因具有獨(dú)特的半纖維素、木質(zhì)素分解酶系，可選擇性降解木質(zhì)素和半纖維素，并且具有能耗低、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，真菌處理成為重要的木質(zhì)纖維素生物預(yù)處理方法[8-10]。但是，真菌處理存在微生物生長周期長、發(fā)酵溫度多為常溫、發(fā)酵過程較難控制等缺點(diǎn)。嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)是一種高效的木質(zhì)纖維素天然降解劑，能夠有效利用植物生物質(zhì)并將其水解產(chǎn)生單糖及其它小分子物質(zhì)[11-12]。研究表明，該菌株的基因序列含有大量編碼木質(zhì)纖維素分解酶的基因，可分泌大量熱穩(wěn)定的碳水化合物分解酶和木質(zhì)素降解酶，從而降解各種不同的生物質(zhì)[13-15]。

傳統(tǒng)的以單一原料為主的生物質(zhì)煉制技術(shù)存在原料供應(yīng)易受地域、儲(chǔ)運(yùn)成本限制等問題。相比而言，混合生物質(zhì)原料具有供應(yīng)更穩(wěn)定、儲(chǔ)量更大、更易于收集等優(yōu)勢(shì)。研究表明，混合生物質(zhì)原料的充分利用可能提高生物乙醇的產(chǎn)量，并提高生物精煉廠的經(jīng)濟(jì)可行性[16-17]。鑒于此，作者以甘蔗渣-棉桿-小麥秸稈 (4∶2∶1，質(zhì)量比)混合生物質(zhì)為研究對(duì)象，考察水熱預(yù)處理參數(shù)對(duì)混合生物質(zhì)中各組分含量的影響；研究嗜熱毀絲霉復(fù)合酶(MTE)與Cel協(xié)同作用下，不同水熱預(yù)處理參數(shù)下制備的混合生物質(zhì)的酶解效率；最后結(jié)合酶解液的UV變化及酶解渣的FTIR圖譜分析，解析MTE與水熱預(yù)處理協(xié)同作用提高混合生物質(zhì)降解效率的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗渣(廣西)、棉桿(河北)、小麥秸稈(河北)，在60 ℃真空干燥箱中烘干至恒重，并粉碎至60目。按質(zhì)量比4∶2∶1將甘蔗渣、棉桿、小麥秸稈混合，制備混合生物質(zhì)。采用美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法[18]分析混合生物質(zhì)中主要組分的含量，其中酸不溶木質(zhì)素、葡聚糖、木聚糖的含量分別為21.2%、36.5%、19.6%。

纖維素酶(Cel)，諾維信公司；其它試劑未特殊標(biāo)注均為分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司等。

H1650型臺(tái)式高速離心機(jī)、H2050R-1型高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司;754PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司;LC-20A型二元高壓液相色譜儀，日本島津;Y92-ⅡN型超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司;S-450型掃描電子顯微鏡，日立公司;System 2000型紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer公司。

1.2 菌種

嗜熱毀絲霉(M.thermophilaDSM 1799)，德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)。

1.3 發(fā)酵液的制備

將嗜熱毀絲霉接種于土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中，28 ℃培養(yǎng)5 d后，保存于冰箱中，備用。

將嗜熱毀絲霉菌絲接種至土豆葡萄糖培養(yǎng)基 (PDB)中，于50 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，得種子液；然后按5%的接種量將種子液接種至PDB培養(yǎng)基中，于50 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)5～7 d，即得嗜熱毀絲霉發(fā)酵液。

1.4 嗜熱毀絲霉復(fù)合酶的制備

將嗜熱毀絲霉發(fā)酵液于8 000 r·min-1離心10 min，分離菌體和發(fā)酵液；將菌體細(xì)胞重懸于1/5～1/10發(fā)酵液體積的50 mmol·L-1pH值 7.4的Tris-HCl緩沖液中，冰浴下進(jìn)行超聲破碎；將混合物于10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，即為嗜熱毀絲霉胞內(nèi)酶液。

將嗜熱毀絲霉發(fā)酵液和胞內(nèi)酶液合并后，加入硫酸銨至濃度為80%，4 ℃靜置，充分沉淀蛋白質(zhì)，于10 000 r·min-1離心10 min，取沉淀溶于0.2 mol·L-1pH 值5.0 的PBS緩沖液后，裝入透析袋中，于4 ℃透析去除硫酸銨，即得MTE。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法[19]測(cè)得MTE的總蛋白含量為23.5 mg·mL-1。

1.5 混合生物質(zhì)水熱預(yù)處理

將混合生物質(zhì)加入高溫高壓反應(yīng)釜反應(yīng)罐中，并按固液比1∶10(g∶mL，下同)加入蒸餾水；反應(yīng)釜密封后加熱至預(yù)設(shè)溫度，恒溫一定時(shí)間，迅速冷卻至室溫；泄壓，抽濾，收集生物質(zhì)殘?jiān)退庖?；記錄水解液的體積，生物質(zhì)殘?jiān)栏珊髠溆?。按?1)計(jì)算水熱預(yù)處理強(qiáng)度(PS)[20]：

(1)

式中：t1為反應(yīng)器溫度達(dá)到100 ℃的時(shí)刻，min;t2為反應(yīng)器溫度冷卻至100 ℃的時(shí)刻，min;T為反應(yīng)器溫度，℃。

1.6 混合生物質(zhì)的酶解

按以下3種方式進(jìn)行水熱預(yù)處理生物質(zhì)殘?jiān)拿附猓?1)加入MTE處理24 h后，加入Cel進(jìn)行酶解，記為MTE-Cel；(2) 同時(shí)加入MTE與Cel進(jìn)行酶解，記為MTE+Cel； (3)僅加入Cel進(jìn)行酶解，記為Cel。MTE加量為10 mg蛋白·(g底物)-1，Cel加量為40 U·(g底物)-1。

酶解操作為：取水熱預(yù)處理生物質(zhì)殘?jiān)? g，加入酶，以0.02 mol·L-1pH 值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)酶解體系的固液比為1∶20；攪拌均勻后，于50 ℃、180 r ·min-1振蕩酶解；真空抽濾進(jìn)行固液分離，用20 mL蒸餾水洗滌酶解渣，洗滌液與酶解濾液合并得到酶解液，酶解渣晾干，備用。

按式(2)計(jì)算酶解總糖得率(ST,%)：

(2)

式中：mge和mxe分別為酶解液中葡萄糖和木糖質(zhì)量，g；mgb和mxb分別為酶解前原料中葡聚糖和木聚糖質(zhì)量，g;0.9為葡萄糖和葡聚糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為木糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

按式(3)計(jì)算MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效率(SE,%)：

(3)

式中：STMTE和STCel分別為MTE協(xié)同酶解方式下和Cel單獨(dú)酶解方式下得到的總糖得率，%。

1.7 分析方法

1.7.1 葡萄糖和木糖含量的測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定葡萄糖、木糖的含量[21]。色譜條件：色譜柱為Aminex HPX-87H (300 mm×7.8 mm，Bio-Rad Laboratories Inc.)，流動(dòng)相為脫氣處理的5 mmol·L-1H2SO4，流速為0.6 mL· min-1，柱溫為65 ℃，示差檢測(cè)器溫度為40 ℃。

1.7.2 混合生物質(zhì)組分分析

采用NREL的兩步酸水解法[18]分析混合生物質(zhì)中主要組分。稱取0.3 g混合生物質(zhì)，加入3 mL 72%濃硫酸，30 ℃保溫60 min后，再加入84 mL去離子水，于121 ℃水解60 min后，取出冷卻至室溫；抽濾分離生物質(zhì)殘?jiān)退庖骸Ｈ? mL水解液，采用HPLC法測(cè)定葡萄糖和木糖含量；生物質(zhì)殘?jiān)?jīng)洗滌后，置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，測(cè)定酸不溶性的木質(zhì)素含量。按式(4)～(6)分別計(jì)算葡聚糖、木聚糖和木質(zhì)素的降解率：

(4)

(5)

(6)

式中：V為水解液的體積，mL；cg、cx分別為水解液中葡萄糖含量、木糖含量，g·mL-1；mg、mx分別為水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)中葡聚糖、木聚糖的質(zhì)量，g；m0、m1分別為水熱預(yù)處理前、后混合生物質(zhì)中木質(zhì)素的質(zhì)量，g。

1.7.3 酶解液的UV分析

將酶解液以適量蒸餾水稀釋，在220～450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.7.4 酶解渣的FTIR分析

分別取約1 mg混合生物質(zhì)及酶解渣樣品，加入約200 mg干燥的溴化鉀，充分研磨后壓片，進(jìn)行FTIR分析。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描10次進(jìn)行光譜累加，環(huán)境氣氛為空氣[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 水熱預(yù)處理參數(shù)對(duì)混合生物質(zhì)中各組分含量的影響

水熱預(yù)處理溫度和時(shí)間對(duì)混合生物質(zhì)中各組分含量的影響如圖1所示。

圖1 水熱預(yù)處理溫度和時(shí)間對(duì)混合生物質(zhì)中各組分含量的影響

從圖1可以看出，總體來說，相對(duì)于未處理原料，水熱預(yù)處理使混合生物質(zhì)中葡聚糖和木質(zhì)素含量增加，而木聚糖含量顯著減少。

在140～170 ℃范圍內(nèi)，混合生物質(zhì)中葡聚糖含量變化不明顯；但是當(dāng)溫度升高至180 ℃時(shí)，葡聚糖含量有所減少。

木聚糖含量隨著水熱預(yù)處理溫度升高而不斷減少。在維溫時(shí)間為10 min、溫度由140 ℃升至150 ℃和由170 ℃升至180 ℃時(shí)，混合生物質(zhì)中木聚糖含量分別減少了5.08 %和41.1%。木聚糖降解率隨維溫時(shí)間延長而升高，且高溫區(qū)維溫時(shí)間對(duì)木聚糖降解率的影響更為顯著。在140 ℃下維溫時(shí)間由10 min延長至30 min時(shí)，木聚糖降解率僅提高11.74% (由9.69%升高至21.43%)；而在180 ℃下維溫時(shí)間由5 min延長至10 min時(shí)，木聚糖降解率則提高了45.4%，達(dá)到81.6%。

木質(zhì)素含量隨著水熱預(yù)處理溫度的升高和水熱預(yù)處理時(shí)間的延長呈增加的趨勢(shì)，最大含量達(dá)到32.6%。維溫時(shí)間為10 min、溫度從140 ℃升至150 ℃和從170 ℃升至180 ℃時(shí)，混合生物質(zhì)中木質(zhì)素含量分別增加了5.19%和22.1%。維溫時(shí)間對(duì)木質(zhì)素降解率的影響也較大，在160 ℃維溫10 min和180 ℃維溫5 min，木質(zhì)素含量分別增加了16.98%和38.68%。但是，在各溫度下，延長維溫時(shí)間對(duì)于木質(zhì)素含量的增加影響并不明顯。

總體而言，水熱預(yù)處理對(duì)混合生物質(zhì)中各組分含量的變化趨勢(shì)與已有報(bào)道[23-24]較為一致。木聚糖含量的變化主要是由半纖維素的降解引起的。通常，水熱預(yù)處理中半纖維素首先降解為木糖低聚物、葡萄糖醛酸和乙酸等。半纖維素的降解打破了原料致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有利于提高后續(xù)酶解過程中酶的生物可及性[25-27]。但是過高的水熱預(yù)處理強(qiáng)度下，上述初級(jí)產(chǎn)物可被二次降解為木糖單體、糠醛、5-羥甲基糠醛、乙醇酸、甲酸等抑制物質(zhì)，從而對(duì)酶解產(chǎn)生不利影響[23，28-29]。由于多糖類組分的降解，原料中木質(zhì)素含量隨著水熱預(yù)處理強(qiáng)度的升高而增加。另一方面，多糖降解物以及水解液中的小分子物質(zhì)之間發(fā)生再凝集反應(yīng)生成酸不溶性的木質(zhì)素類似物，這些物質(zhì)會(huì)沉積在纖維素表面，也會(huì)造成水熱預(yù)處理后木質(zhì)素含量增加[30-31]。而木質(zhì)素對(duì)于后續(xù)混合生物質(zhì)的酶解存在諸多不利影響，包括影響Cel活性和酶吸附、解吸效率等，進(jìn)而影響酶解效率[32-35]。

相近水熱預(yù)處理強(qiáng)度下混合生物質(zhì)中各組分含量變化如表1所示。

表1 相近水熱預(yù)處理強(qiáng)度下混合生物質(zhì)中各組分含量變化

從表1可以看出，溫度是影響各組分含量變化的主要因素，150 ℃維溫30 min時(shí)，木質(zhì)素含量為(26.50±1.33)%；而180 ℃維溫5 min時(shí)，木質(zhì)素含量為(29.40±1.35)%。可見，高溫會(huì)導(dǎo)致葡聚糖降解及木質(zhì)素含量增加，不利于后續(xù)混合生物質(zhì)的酶解。

2.2 水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)多酶協(xié)同酶解

不同酶解方式下，不同水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)的總糖得率及協(xié)同酶解效率如圖2所示。

在不同酶解方式下，混合生物質(zhì)的總糖得率均隨水熱預(yù)處理強(qiáng)度升高而升高。混合生物質(zhì)的酶解總糖得率隨水熱預(yù)處理溫度升高而升高，維溫時(shí)間為20 min、溫度從140 ℃升至180 ℃時(shí)，混合生物質(zhì)的Cel酶解總糖得率從36.51%升至79.21%，而MTE-Cel和MTE+Cel的總得糖率則均升至約85%(圖2a)。在140～170 ℃范圍內(nèi)，隨著維溫時(shí)間的延長，混合生物質(zhì)的酶解總糖得率也隨之升高；但是當(dāng)水熱預(yù)處理溫度為180 ℃且維溫時(shí)間超過20 min時(shí)，酶解總糖得率降低(圖2b)。這可能是由于，一方面，長時(shí)間高溫水熱預(yù)處理得到的混合生物質(zhì)中含有的糠醛、羥甲基糠醛、木質(zhì)素降解物等物質(zhì)對(duì)酶的活性具有抑制作用[4]；另一方面，長時(shí)間高溫水熱預(yù)處理?xiàng)l件下，由于一些酸不溶性木質(zhì)素類似物沉積在纖維素表面，限制了纖維素對(duì)酶的可及性，并且在酶促水解過程中造成Cel的無效吸附，從而影響水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)的酶解效率[31，36-37]。

圖2 不同酶解方式下，不同水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)的總糖得率及協(xié)同酶解效率

MTE-Cel和MTE+Cel酶解方式均具有明顯的協(xié)同酶解效果。在MTE-Cel酶解方式下，混合生物質(zhì)的總糖得率略高于MTE+Cel酶解方式。當(dāng)維溫時(shí)間為10 min、溫度由140 ℃升至160 ℃時(shí)，MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效率逐漸升高，并在160 ℃時(shí)達(dá)到最高，為53.6%，之后協(xié)同酶解效率迅速降低(圖2a)。而維溫時(shí)間在20 min和30 min時(shí)，MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效率均隨溫度升高而快速降低，在180 ℃維溫20 min和30 min時(shí)，MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效率分別為7.7%和7.4%。而水熱預(yù)處理時(shí)間對(duì)MTE協(xié)同Cel水解生物質(zhì)的影響也存在較大的差異。在140 ℃分別維溫10 min、20 min和30 min的混合生物質(zhì)，經(jīng)MTE+Cel酶解的總糖得率較Cel單獨(dú)酶解分別提高了28.17%、48.21%和53.21%。而在150 ℃下維溫10 min，MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效率為35.8%，之后延長預(yù)處理時(shí)間對(duì)協(xié)同酶解效率的影響不大。在160～180 ℃范圍內(nèi)，協(xié)同酶解效率則隨維溫時(shí)間延長而快速降低 (圖2b)。這說明，MTE與Cel協(xié)同作用可以降低水熱預(yù)處理強(qiáng)度，從而達(dá)到減少能耗的目的。而當(dāng)水熱預(yù)處理強(qiáng)度較高的情況下，MTE對(duì)Cel的協(xié)同酶解效果減弱。

MTE具有協(xié)同酶解作用主要是由于，在嗜熱毀絲霉的基因序列中含有大量編碼木質(zhì)纖維素分解酶的基因，如木聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶(CMCase)、β-葡萄糖苷酶以及與木質(zhì)素降解有關(guān)的漆酶基因等，這使得該菌可以將木質(zhì)纖維素原料有效降解為單糖及其它小分子物質(zhì)[13-15，38]。其中，漆酶及其介體催化體系是催化木質(zhì)素降解的重要催化劑之一。而經(jīng)水熱預(yù)處理的生物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生一定量的木質(zhì)素衍生物，這些小分子物質(zhì)一些已經(jīng)被證實(shí)可以作為漆酶的介體，構(gòu)成漆酶-介體催化體系催化木質(zhì)素的降解[41]，從而達(dá)到降低木質(zhì)素含量，減少木質(zhì)素引起的Cel無效吸附等。但是，高水熱預(yù)處理強(qiáng)度下，木質(zhì)素的降解物濃度過高，會(huì)導(dǎo)致MTE酶活性的降低甚至失活。另外，一些具有低聚結(jié)構(gòu)的降解物還會(huì)引起聚集體的形成，也會(huì)導(dǎo)致酶的失活。因此，確定以160 ℃維溫10 min對(duì)混合生物質(zhì)進(jìn)行水熱預(yù)處理，再以MTE+Cel協(xié)同酶解來實(shí)現(xiàn)混合生物質(zhì)的高效生物降解。

2.3 酶解液的UV分析

生物質(zhì)中具有紫外吸收的物質(zhì)主要來自于木質(zhì)素降解產(chǎn)物，160 ℃維溫10 min水熱預(yù)處理的混合生物質(zhì)在不同酶解方式下酶解液的UV圖譜如圖3所示。

通常190 nm附近和270～300 nm范圍內(nèi)的紫外吸收峰歸屬于含有羰基的飽和醛酮類化合物。而在α、β-不飽和醛酮中，羰基與乙烯基產(chǎn)生的π-π共軛作用使上述兩個(gè)譜帶紅移至220～260 nm和310～330 nm。從圖3可以看出，酶解前，溶液中由于水熱預(yù)處理殘留的木質(zhì)素降解產(chǎn)物的存在，在280 nm附近具有較弱的紫外吸收；酶解后，酶解液在280 nm附近的吸收峰強(qiáng)度均有所升高。280 nm處是含有酚羥基物質(zhì)的特征紫外吸收峰。Cel作用下，混合生物質(zhì)中的纖維素被水解，從而使得吸附在混合生物質(zhì)表面的木質(zhì)素殘?jiān)约澳蹜B(tài)假木質(zhì)素等被釋放出來，引起紫外吸收強(qiáng)度的升高。而MTE與Cel協(xié)同作用的酶解液在330 nm處的吸收峰強(qiáng)度也明顯升高，尤其是MTE-Cel酶解方式下，酶解液在330 nm處的吸收峰強(qiáng)度顯著高于其它兩種方式。而對(duì)于木質(zhì)素可溶性降解產(chǎn)物，330 nm處的吸收峰主要?dú)w屬于具有強(qiáng)共軛體系的不飽和醛酮類物質(zhì)，如黃酮、香豆素類等多酚類物質(zhì)以及一些茋類化合物[42]。這說明，MTE的加入可以進(jìn)一步催化木質(zhì)素降解產(chǎn)生具有不飽和共軛結(jié)構(gòu)的降解產(chǎn)物。

圖3 不同酶解方式下,水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)酶解液的UV圖譜

2.4 酶解渣的FTIR分析

不同酶解方式下，水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)酶解渣的FTIR圖譜如圖4所示。

從圖4可以看出，3 385 cm-1附近為酚羥基和脂羥基O-H伸縮振動(dòng)，經(jīng)過Cel單獨(dú)酶解或者經(jīng)與MTE協(xié)同酶解后的相對(duì)吸收強(qiáng)度均有所升高，尤其是兩者協(xié)同作用下的吸收強(qiáng)度顯著升高；2 925 cm-1附近為甲基亞甲基C-H伸縮振動(dòng)，經(jīng)酶解后吸收強(qiáng)度都略有升高；1 645 cm-1處為木質(zhì)素苯環(huán)結(jié)構(gòu)中共軛羰基C=O伸縮振動(dòng)，經(jīng)MTE與Cel協(xié)同酶解后吸收強(qiáng)度顯著升高，而Cel單獨(dú)酶解升幅較小。1 608 cm-1處為芳香核及C=O伸縮振動(dòng)、1 510 cm-1處為芳香核振動(dòng)，在3種酶解方式下，1 608 cm-1、1 510 cm-1處吸收強(qiáng)度均有升高，但Cel酶解方式下的增幅明顯低于MTE+Cel和MTE-Cel。這可能是由于，經(jīng)過酶解后，原料中主要組分是木質(zhì)素，因此木質(zhì)素的特征吸收峰均變得更加明顯，且吸收強(qiáng)度明顯升高。1 456 cm-1處為木質(zhì)素芳香環(huán)上的C-H變形振動(dòng)；1 421～1 423 cm-1處為纖維素-CH2和C-H伸縮振動(dòng)及芳香環(huán)上C-H平面變型振動(dòng)。1 370～1 380cm-1處為纖維素和木質(zhì)素中C-H彎曲振動(dòng)，吸收強(qiáng)度均降低，表明纖維素與木質(zhì)素間相互作用已被破壞?？梢酝茰y(cè)，經(jīng)不同方式酶解后，纖維素與木質(zhì)素之間的連接均被破壞，從而造成Cel單獨(dú)酶解時(shí)，因原料中木質(zhì)素的釋放而引起3 385 cm-1、1 608 cm-1、1 510 cm-1和1 370～1 380 cm-1處吸收強(qiáng)度升高。但是由于MTE中不僅含有木質(zhì)纖維素分解酶而且還含有少量木質(zhì)素氧化酶，因此MTE協(xié)同酶解時(shí)，不僅上述吸收強(qiáng)度會(huì)更明顯升高，而且1 645 cm-1處共軛羰基C=O吸收峰顯著升高。1 325～1 330 cm-1處為特有的紫丁香基吸收峰。1 241～1 245 cm-1處為愈創(chuàng)木基環(huán)伸縮振動(dòng)及C=O伸縮振動(dòng)。1 158～1 169 cm-1和1 034～1 038 cm-1處分別為纖維素和半纖維素的骨架結(jié)構(gòu)中的C-O-C伸縮振動(dòng)和C-O伸縮振動(dòng)；895～898 cm-1處為纖維素中葡萄糖環(huán)的伸縮振動(dòng)，經(jīng)不同方式酶解后，這兩處的相對(duì)吸收強(qiáng)度均有不同程度的降低。說明經(jīng)酶處理后，混合生物質(zhì)中的纖維素含量降低。

圖4 不同酶解方式下，水熱預(yù)處理混合生物質(zhì)酶解渣的 FTIR圖譜

3 結(jié)論

以甘蔗渣-棉桿-小麥秸稈(4∶2∶1，質(zhì)量比)混合生物質(zhì)為研究對(duì)象，進(jìn)行了水熱預(yù)處理與MTE生物處理協(xié)同高效降解的研究，得到以下結(jié)論：

(1)水熱預(yù)處理溫度是影響混合生物質(zhì)中各組分含量變化的主要因素，在相近水熱預(yù)處理強(qiáng)度下，經(jīng)150 ℃維溫30 min和180 ℃維溫5 min處理的混合生物質(zhì)中木質(zhì)素含量分別為(26.50±1.33)%和(29.40±1.35)%。高溫會(huì)導(dǎo)致葡聚糖降解及較高的木質(zhì)素含量，從而不利于后續(xù)混合生物質(zhì)的酶解。

(2)MTE對(duì)Cel具有明顯的協(xié)同作用，且受水熱預(yù)處理溫度的影響較大。MTE對(duì)經(jīng)160 ℃維溫10 min處理的混合生物質(zhì)的Cel酶解協(xié)同效率最高達(dá)(53.60±2.68)%，酶解總糖得率達(dá)(75.50±3.77)%。而繼續(xù)升高溫度或者延長維溫時(shí)間，雖然酶解總糖得率略有升高，但MTE的協(xié)同酶解效率快速降低?？梢?，MTE的協(xié)同作用可以降低水熱預(yù)處理強(qiáng)度。

(3)UV分析顯示，MTE協(xié)同酶解可使酶解液在280 nm和330 nm處的吸收強(qiáng)度顯著升高，結(jié)合酶解渣的FTIR光譜分析，推測(cè)MTE中豐富的木質(zhì)纖維素分解酶和木質(zhì)素氧化酶不僅可以破壞纖維素與木質(zhì)素之間的連接，而且可直接降解木質(zhì)素產(chǎn)生具有不飽和共軛結(jié)構(gòu)的可溶性物質(zhì)，達(dá)到減少木質(zhì)素對(duì)Cel的無效吸附，并提高酶解效率的作用。