盧 山 錢(qián) 蕓 夏文卿 汪 容 唐 波

西洛他唑（cilostazol，CLZ）是一種磷酸二酯酶Ⅲ抑制劑，用于腦梗死后的抗血小板聚集治療。前期研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦梗死急性期給予CLZ 治療，可改善小鼠腦梗死區(qū)域的腦血流量，并促進(jìn)小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活化[1]。本研究通過(guò)測(cè)定腦梗死模型小鼠CLZ 治療后腦梗死區(qū)域的血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量，以及通過(guò)測(cè)定加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）培養(yǎng)的小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞BrdU 陽(yáng)性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)，從而明確CLZ 是否具備促進(jìn)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的能力?，F(xiàn)將報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SPF 級(jí)8 周齡雄性Icr 小鼠12 只，體質(zhì)量18.0～23.0（20.0±3.0）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，SCXK（滬）2018-0006），置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房12h 明暗周期循環(huán)，控制室溫為（21±2）℃。制備腦梗死模型后1 周內(nèi)予以粉狀飼料飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)取得浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理審批編號(hào)：20191216-22。

1.2 細(xì)胞株 CRL-2299 系列小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞，由美國(guó)ATCC 公司提供。

1.3 試 劑 CD31 抗體（批號(hào)sc-376764，規(guī)格：200μg/mL，公司：Sante Cruz）；山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor 488（批號(hào)ab150113，規(guī)格：500μg，公司：ABCAM）；Brdu 抗體（批號(hào)B2531，規(guī)格：100μL，公司：sigma）；山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555）（批號(hào)ab150078，規(guī)格：500μg，公司：ABCAM）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（批號(hào)28718-90-3，規(guī)格：10mg，公司：kirkegaard&Perry）。

1.4 藥 物 CLZ（批號(hào)190106P，規(guī)格：50mg/粒），由浙江大冢制藥有限公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 為保證腹腔注射給藥劑量的穩(wěn)定性，將CLZ 粉碎后用羥乙基-β-環(huán)糊精（2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HPβCD）制備成性質(zhì)較穩(wěn)定濃度為5%的CLZ 懸濁液。

2.2 小鼠腦梗死模型建立 12 只小鼠均使用3%異氟烷誘導(dǎo)全身麻醉及1.5%異氟烷維持麻醉，以右側(cè)臥位固定，暴露左側(cè)顳部，消毒后于左耳外耳道至左眼連線中點(diǎn)處剪開(kāi)皮膚，鈍性分離靜脈、唾液腺及肌肉，并電凝阻斷手術(shù)視野內(nèi)所見(jiàn)血管。分離相關(guān)組織至左側(cè)顴骨顴弓區(qū)，剪斷顴骨，繼續(xù)分離肌肉及相關(guān)組織至顱底，在嗅索區(qū)域使用骨鉆去除顱骨，分離已暴露的硬腦膜，充分暴露左側(cè)大腦中動(dòng)脈，在近嗅索區(qū)使用雙極電凝器阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈，并用顯微剪剪斷已電凝阻斷部位的殘余血管以確保血管阻斷。于手術(shù)區(qū)域加入動(dòng)物用抗生素，將之前鈍性分離的組織復(fù)位，縫合皮膚。術(shù)后將小鼠放入恒溫箱內(nèi)觀察，待完全脫離麻醉狀態(tài)后繼續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。手術(shù)過(guò)程中將小鼠體溫控制于（37.0±0.2）℃。建模成功后，小鼠左側(cè)大腦即出現(xiàn)局限于大腦皮層的腦梗死病灶。

2.3 分組及給藥 將完成建模手術(shù)后的小鼠分為CLZ 組和HPβCD 組，每組6 只，分別予以50μL CLZ懸濁液及50μL HPβCD 溶液進(jìn)行腹腔注射（1 次/日）。注射開(kāi)始7 天后，使用異氟烷進(jìn)行深度麻醉并使用4%甲醛對(duì)建模小鼠進(jìn)行循環(huán)灌注，然后按16mm 厚度進(jìn)行大腦冰凍切片制作，并對(duì)切片進(jìn)行CD31 免疫熒光標(biāo)記，并使用Alexa-conjugated（Alexa Fluor 488 or 555）進(jìn)行顯色標(biāo)記。使用4，6-二氨基－2－苯基吲哚（4'，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。制作完成的小鼠大腦切片使用共聚焦鐳射顯微鏡進(jìn)行觀察拍攝，并使用ImageJ 的彩色無(wú)序圖像外輪廓提取方法對(duì)所得到圖像進(jìn)行腦梗死區(qū)域及缺血半暗帶區(qū)域進(jìn)行CD31 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞密度測(cè)定及分析。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 在24 孔培養(yǎng)皿中使用血管內(nèi)皮培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞（細(xì)胞濃度：1×104cells/well）。培養(yǎng)1 天后，分別換用加入含有4μg 5%濃度CLZ 懸濁液的血管內(nèi)皮培養(yǎng)液（共500μL）繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)照組使用分別添加4μg 的HPβCD 血管內(nèi)皮培養(yǎng)液。在培養(yǎng)開(kāi)始第4 天時(shí)，往各組培養(yǎng)皿中加入BrdU（10μg/mL）。于第5 天時(shí)固定細(xì)胞，并使用BrdU 顯色抗體進(jìn)行顯色染色，每個(gè)培養(yǎng)皿相同區(qū)域于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)以及BrdU 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 兩組小鼠大腦冰凍切片CD31 染色標(biāo)記圖像及圖像數(shù)據(jù)分析 通過(guò)使用ImageJ 彩色無(wú)序圖像外輪廓提取方法，提取出A-D 中CD31 陽(yáng)性標(biāo)記（紅色標(biāo)記）區(qū)塊面積和各切片病理組織區(qū)塊總面積（簡(jiǎn)稱(chēng)為總面積）。（見(jiàn)插頁(yè)圖1）CLZ 組CD31 陽(yáng)性標(biāo)記區(qū)域面積占總面積比例（0.101±0.027）較HPβCD（0.049±0.013）組明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。

3.2 小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)相關(guān)分析加入含CLZ（10μg/L）的血管培養(yǎng)液培養(yǎng)的小鼠大腦由來(lái)血管周細(xì)胞在經(jīng)過(guò)5 天培養(yǎng)后，BrdU 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)占DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核數(shù)比值較HPβCD 組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1，插頁(yè)圖2。

圖1 兩組小鼠大腦冰凍切片CD31 染色標(biāo)記圖像及相關(guān)圖像

圖2 兩組小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)及BrdU 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)相關(guān)分析

表1 CLZ 促進(jìn)小鼠大腦由來(lái)血管周細(xì)胞增殖效果影響（個(gè)/高倍鏡，）

表1 CLZ 促進(jìn)小鼠大腦由來(lái)血管周細(xì)胞增殖效果影響（個(gè)/高倍鏡，）

注：CLZ 組給予以50μLCLZ 懸濁液腹腔注射；HPβCD 組給予50μL HPβCD 溶液腹腔注射；與HPβCD 組比較，aP＜0.05

4 討論

CLZ 已在臨床用于腦梗死二級(jí)預(yù)防[2]。通過(guò)已經(jīng)完成的本項(xiàng)目相關(guān)前期研究發(fā)現(xiàn)，CLZ 可明顯增加小鼠腦梗死急性期腦梗死區(qū)域的腦血流量[1]，以及CLZ 可促進(jìn)小鼠大腦由來(lái)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的活性成分生成[3]，這與本項(xiàng)目組既往相關(guān)研究報(bào)道CLZ 可改善機(jī)體組織缺血區(qū)域血流量[4-5]，減少缺血后的組織損傷結(jié)論相符[6-7]。

結(jié)合本項(xiàng)目前期相關(guān)研究結(jié)果，通過(guò)本項(xiàng)目此次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)CLZ 治療的急性腦梗死建模小鼠梗死區(qū)域的CD31 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞所占面積較PBS 及HPβCD 組有明顯增多，因此筆者認(rèn)為CLZ 具備促進(jìn)小鼠腦急性梗死區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力。在進(jìn)一步的離體細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，使用CLZ（10μ/L）組的BrdU 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)與DAPI 陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)比值與PBS 組及HPβCD 組亦有明顯差異，說(shuō)明CLZ 可通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，達(dá)到促進(jìn)小鼠腦梗死后腦梗死區(qū)域的新生血管增殖的效果，相關(guān)研究結(jié)果與已有其他相關(guān)報(bào)道CLZ 可能通過(guò)上調(diào)血管緊張素Ⅱ及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等途徑促血管生成因子的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)缺血區(qū)域血管新生的結(jié)論相符[8-10]，也可進(jìn)一步解釋為CLZ 有改善血管相關(guān)細(xì)胞功能的能力[11-12]，具備促進(jìn)微血管新生[13-15]、改善腦缺血區(qū)域血流量的作用[16]。

綜上所述，CLZ 在腦梗死急性期具備促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖的能力進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)小鼠腦梗死后腦梗死區(qū)域血管新生效果，進(jìn)而起到改善腦梗死區(qū)域腦血流量效果,為腦梗死后缺血區(qū)域受損組織修復(fù)提供必要條件。