和麗，郭楚雅，王雪峰，2，*，普岳紅，2，范江平，2，黃艾祥

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明650201）

隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，人們對(duì)乳及乳制品的需求量不斷增加。當(dāng)前我國在營養(yǎng)層面對(duì)乳及乳制品進(jìn)行研究的同時(shí)，也對(duì)其風(fēng)味進(jìn)行了研究[1]。發(fā)酵乳是乳制品中的一種，是以牛乳或乳粉為原料，發(fā)酵后制成的pH值降低的產(chǎn)品[2-3]，其可分為酸乳和風(fēng)味發(fā)酵乳[4]。發(fā)酵乳具有豐富的營養(yǎng)和良好的保健功能[5-6]，并以其獨(dú)特的風(fēng)味、極高的營養(yǎng)價(jià)值受到越來越多人的喜愛[7]。它可以促進(jìn)人體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收，幫助乳糖不耐癥患者食用牛奶，減少脹氣、腹瀉等癥狀[8]，還可以助消化，潤腸通便且熱量低又不會(huì)胖[9]。然而，目前國內(nèi)外對(duì)調(diào)味料型發(fā)酵乳的研究鮮有報(bào)道，其作為一種新型發(fā)酵乳可以進(jìn)一步豐富發(fā)酵乳的種類。本試驗(yàn)以鮮牛乳、香辛料為原料，利用實(shí)驗(yàn)室自制貫筋藤蛋白酶酶解牛乳[10]，脫去乳清，并以感官評(píng)分為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳發(fā)酵工藝條件，開發(fā)出一款獨(dú)具香辛料風(fēng)味、食用方式多樣性的脫乳清調(diào)料乳，為特色發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供一定的理論應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳、乳清蛋白粉、貫筋藤蛋白酶（酶活力為223.135U/mL）、商業(yè)直投式酸奶發(fā)酵劑（DELVO-YOG?FVV-231DSL直投式菌種）：由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；白砂糖、黑胡椒粉、生姜粉、花椒油、辣椒油、海鹽：市售。

MRS 肉湯培養(yǎng)基、NaOH、酚酞、K2SO4、CuSO4、HCl、H2SO4、甲基紅-溴甲酚綠指示劑、異戊醇：天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SVJ-358型智能商用型酸奶機(jī)：北京世紀(jì)陽光科技發(fā)展有限公司；HPX-9272ME型恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-IF型單人雙面超凈無菌操作臺(tái)：蘇州江東精密儀器有限公司；GMSX-280型壓力蒸汽滅菌器：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；雷磁PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HJJ-6恒溫水浴鍋：常州華奧儀器制造有限公司；NDJ-4型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)：武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝設(shè)計(jì)

生鮮乳→驗(yàn)收→預(yù)熱→均質(zhì)→凝乳→切塊→脫乳清→添加香辛調(diào)味料→攪打→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏后熟→成品。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

組織12位具有一定專業(yè)知識(shí)的人員經(jīng)培訓(xùn)組成評(píng)價(jià)小組，進(jìn)行感官評(píng)分，根據(jù)色澤（25分）、氣味（25分）、組織狀態(tài)（25分）、整體口感（25分）4個(gè)方面對(duì)風(fēng)味調(diào)料乳進(jìn)行評(píng)定，最后得分為12位評(píng)分員評(píng)分的算術(shù)平均值。感官項(xiàng)目權(quán)重的分布見表1。

表1 脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)定評(píng)分表Table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

續(xù)表1 脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)定評(píng)分表Continue table 1 The sensory evaluation of de-whey flavor seasoning fermented milk

1.3.3 香辛料質(zhì)量比對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響

以脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分值為指標(biāo)，參考美式凱撒、法式醬、千島醬等沙拉醬品種及我國居民口味，選用花椒油、辣椒油、海鹽、黑胡椒、生姜粉作為原材料[11]，以生姜粉添加量（g）作為基準(zhǔn)項(xiàng)，按以上排序的不同比例添加到脫乳清發(fā)酵乳中，篩選出最佳香辛料質(zhì)量比。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 凝乳酶添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

貫筋藤凝乳功能成分為一種復(fù)合蛋白酶，主要是分子量為24 kDa的半胱氨酸蛋白酶B，該酶具有耐高溫、耐酸堿性能較好、凝乳活力較高等酶學(xué)特性[12]。以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察貫筋藤凝乳酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分的影響。

1.3.4.2 白砂糖添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分的影響。

1.3.4.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察發(fā)酵時(shí)間（6、8、10、12、14、16 h）對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分的影響。

1.3.4.4 乳清蛋白粉添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響

以感官評(píng)分為指標(biāo)，考察乳清蛋白粉添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，選取感官評(píng)分影響較為顯著的A凝乳酶添加量（%）、B白砂糖添加量（%）、C發(fā)酵時(shí)間（h）、D乳清蛋白粉添加量（%）4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 產(chǎn)品理化及微生物指標(biāo)測定方法

1）酸度的測定：參照GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[13]進(jìn)行測定。

2）蛋白質(zhì)的測定：參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》[14]進(jìn)行測定。

3）脂肪的測定：參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》[15]進(jìn)行測定。

4）微生物指標(biāo)的測定：參照GB 4789.18-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳與乳制品》[16]進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同香辛料質(zhì)量比對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響

不同香辛料質(zhì)量比對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 不同香辛料質(zhì)量比對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different spice ratio on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖1可知，根據(jù)工藝設(shè)計(jì)經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)確定每千克牛奶中添加花椒油12 g、辣椒油10 g、海鹽8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g，即香辛料質(zhì)量比為6∶5∶4∶2∶1的感官評(píng)分最高，該條件下制成的脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳質(zhì)地均勻、香辛料風(fēng)味較佳。

2.2 脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的單因素試驗(yàn)

2.2.1 凝乳酶添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響

凝乳酶添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 凝乳酶添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of the amount of rennin added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

凝乳酶[17]添加量在脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的制備過程中至關(guān)重要，是脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳組織狀態(tài)的主要影響因素。由圖2可以得出：感官評(píng)分在凝乳酶添加量為0.4%時(shí)最高，但之后隨著凝乳酶添加量的增加而下降，發(fā)酵乳口感干澀、帶有苦味，可能是貫筋藤凝乳酶本身含有的澀味隨添加量的增加而愈加苦澀，且影響發(fā)酵乳中的組織狀態(tài)，對(duì)發(fā)酵乳的感官品質(zhì)有所影響[18]。因此，選取最佳凝乳酶添加量為0.4%。

2.2.2 白砂糖添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 白砂糖添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of the amount of white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖3可以得出，隨著白砂糖添加量的增加，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分逐漸升高之后有降低的趨勢，當(dāng)白砂糖添加量為4%時(shí)，風(fēng)味調(diào)味乳的感官品質(zhì)最高，感官評(píng)分為81.5分，白砂糖可以為調(diào)料乳中乳酸菌的生長繁殖提供豐富的碳源，還可以作為甜味劑，賦予調(diào)料乳更好的風(fēng)味。當(dāng)白砂糖添加量較低時(shí)，乳酸菌的繁殖能力較低，并且產(chǎn)酸和產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的能力較弱；當(dāng)白砂糖添加量過高時(shí)，酸奶中的甜度突出，抑制了乳酸菌的生長繁殖[19]，因此導(dǎo)致調(diào)料乳酸甜口感消失且不符合當(dāng)代人們飲食的健康性，對(duì)發(fā)酵乳的感官品質(zhì)有所影響[20]。降低了風(fēng)味調(diào)料乳的感官品質(zhì)。故白砂糖最佳添加量為4%。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖4可以得出，隨著脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳發(fā)酵時(shí)間的延長，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳發(fā)酵在不斷進(jìn)行，感官評(píng)分呈上升趨勢，但在發(fā)酵14 h后，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分開始降低；前期可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過短，調(diào)料乳酸度不足且不凝固，而后期隨著發(fā)酵時(shí)間延長，調(diào)料乳酸味過重，遮蓋了脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的風(fēng)味，影響脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的滋味[21]。故選取最適發(fā)酵時(shí)間為14 h。

2.2.4 乳清蛋白粉添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響

乳清蛋白粉添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響見圖5。

圖5 乳清蛋白粉添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of the amount of whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖5可以得出，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分隨著乳清蛋白粉添加量的增加而先上升后下降，乳清蛋白粉添加量在0.6%處達(dá)到最大值。隨著乳清蛋白粉添加量的增加，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分反而降低，可能因?yàn)槿榍宓鞍追圻^高，導(dǎo)致發(fā)酵乳的風(fēng)味、口感下降，且發(fā)酵乳組織狀態(tài)過于凝固[22]，香辛調(diào)味料攪拌后分布不均勻，影響了感官評(píng)分。故選取最適乳清蛋白粉添加量為0.6%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳生產(chǎn)工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過擬合二次方程計(jì)算最優(yōu)工藝組合以及脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳最大理論值。選擇凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Response surface analysis and results

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表3進(jìn)行多元回歸擬合，分別對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳生產(chǎn)工藝條件凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results

由表4方差分析可知，感官評(píng)分回歸模型顯著性檢驗(yàn)P＜0.000 1，說明二次多元回歸模型極顯著；感官評(píng)分回歸模型失擬性檢驗(yàn)P=0.362 9＞0.05，可以認(rèn)為所選脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性充分模型失擬不顯著。脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分回歸診斷表明，決定系數(shù)R2=84.10%，說明脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分的變化有84.10%源于凝乳酶添加量、白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間和乳清蛋白粉添加量；信噪比=7.301，這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分評(píng)價(jià)。離散系數(shù)C.V為標(biāo)準(zhǔn)差與均值的比值，表示試驗(yàn)本身的精確度，C.V值越低，試驗(yàn)的可靠性越高[22]，本試驗(yàn)產(chǎn)品感官評(píng)分?jǐn)M合C.V值為3.62%，可靠性較高。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分，說明試驗(yàn)操作可信度高，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。由回歸系數(shù)顯著性表明，在所取因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分影響的順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間（C）＞凝乳酶添加量（A）＞白砂糖添加量（B）＞乳清蛋白粉添加量（D）。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化

圖6～圖8是響應(yīng)面變化三維曲面，可直觀地反映脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳中凝乳酶添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）和乳清蛋白粉添加量（D）交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著[23-24]。

圖6 凝乳酶添加量、白砂糖添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.6 Effect of the amount of rennin added and white sugar added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

圖7 白砂糖添加量、乳清蛋白粉添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.7 Effect of the amount of white sugar added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

由圖6～圖8可知，A與B，B與D，A與D之間對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分影響較大。脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分隨脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳凝乳酶添加量及白砂糖添加量的增加而呈先上升后降低的趨勢，凝乳酶添加量及白砂糖添加量為0.4%及4%時(shí)，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分值最大，與單因素和方差分析結(jié)果相符；由圖7可知，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分隨脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳白砂糖添加量和乳清蛋白粉添加量的增加而呈逐漸升高后下降的趨勢，白砂糖添加量及發(fā)酵時(shí)間為4%及0.6%時(shí)，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分值最大，交互作用顯著和方差分析結(jié)果一致；由圖8可知，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官評(píng)分隨著脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量的增加感官評(píng)分呈先上升后降低的趨勢，凝乳酶添加量及乳清蛋白粉添加量為0.4%及0.6%時(shí)，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分值最大，與單因素和方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最佳條件確定和回歸模型驗(yàn)證

回歸模型通過響應(yīng)面分析法得到最優(yōu)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳工藝條件，并根據(jù)設(shè)備情況對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

圖8 凝乳酶添加量、乳清蛋白粉添加量對(duì)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳感官品質(zhì)的影響Fig.8 Effect of the amount of rennin added and whey protein powder added on the sensory quality of de-whey flavor seasoning fermented milk

表5 脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳最佳工藝條件驗(yàn)證Teble 5 Verification of the optimum technological conditions for de-whey flavor seasoning fermented milk

由表5可知，回歸模型通過響應(yīng)面法得到最優(yōu)脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳工藝條件為凝乳酶添加量0.41%，白砂糖添加量3.87%，發(fā)酵時(shí)間14.4 h，乳清蛋白粉添加量0.58%。考慮實(shí)際操作情況與設(shè)備參數(shù)狀況，確定脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳最佳工藝條件為：凝乳酶的添加量0.4%，白砂糖添加量4%，發(fā)酵時(shí)間14 h，乳清蛋白粉添加量0.6%，在上述最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的感官評(píng)分值為86.15±1.37，與理論值85.250 3接近。

2.4 產(chǎn)品理化和衛(wèi)生指標(biāo)

產(chǎn)品理化和衛(wèi)生指標(biāo)見表6。

表6 理化和衛(wèi)生指標(biāo)Table 6 The chemical and health indicators

由表6可得出，脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的酸度約為90°T、蛋白質(zhì)含量約為7.79%、脂肪含量約為5.16%、黏度為 7 300 mPa·s、活菌數(shù)約為 3.8×107CFU/mL，大腸菌群未檢出，各項(xiàng)指標(biāo)均符合GB 19302-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用直投式菌種作為脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的發(fā)酵劑，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的最佳生產(chǎn)工藝條件為香辛料質(zhì)量比為6∶5∶4 ∶2 ∶1（花椒油 12 g、辣椒油 10 g、海鹽 8 g、黑胡椒粉4 g、生姜粉2 g）、凝乳酶添加量0.4%、白砂糖添加量4%、發(fā)酵時(shí)間14 h、乳清蛋白粉添加量0.6%。該條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品各項(xiàng)理化指標(biāo)為蛋白質(zhì)含量7.79%、脂肪含量 5.16%、酸度 90 °T、黏度為 7 300 mPa·s、活菌數(shù)約為3.8×107CFU/mL，且產(chǎn)品色香味俱佳、蛋白質(zhì)豐富、口感濃郁，且風(fēng)味獨(dú)特、具有香辛料氣味。脫乳清風(fēng)味調(diào)料乳的研究，為特色發(fā)酵乳產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供一定的理論應(yīng)用參考。