張耀全，馬 欣，羅珠珠,，牛伊寧，李玲玲，蔡立群,，謝軍紅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，是西部黃土高原退耕還林的主要草種[1]，它不僅耐貧瘠，產(chǎn)量高[2]，而且具有土壤改良、培肥地力、植物修復等眾多生態(tài)功能。苜蓿的根瘤可以固定空氣中的游離氮，從而增加土壤氮素含量，同時苜蓿地上部枯枝落葉及地下部凋亡的須根可以經(jīng)微生物分解增加土壤有機碳含量，改善土壤質(zhì)量[3]。有研究發(fā)現(xiàn)苜蓿在水土保持方面也有著重要作用，主要是因為苜蓿在生長期間可以完全遮蔽地表，提高表層土壤抗沖蝕的能力，并且其根部深入土壤，能提高土壤聚合力，從而達到減少土壤侵蝕，防止土壤質(zhì)量退化的目的[4-7]。我國西北黃土高原地區(qū)屬干旱半干旱氣候，降雨量少，地表植物稀疏，土壤肥力低下，溝壑縱橫，長期以來土壤水蝕非常嚴重，生態(tài)環(huán)境極度脆弱[8]。紫花苜蓿由于抗逆性強，長期以來一直是該地區(qū)生態(tài)恢復的首選牧草，在生態(tài)環(huán)境修復、土壤結(jié)構(gòu)改善及土壤肥力提升方面發(fā)揮著重要作用。

目前，關(guān)于西部黃土高原紫花苜蓿的研究大都集中在不同種植年限苜蓿的水分效應[5,20-21]、地上生物量[2,6]、溫室氣體排放[22]等方面，而關(guān)于土壤微生物介導的養(yǎng)分循環(huán)過程相對較少，特別是氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟——氨氧化過程研究幾乎未見報道。苜蓿種植可以提高土壤氮固存，但土壤氮增加達到峰值的年限因研究區(qū)域不同而異。有研究表明種植苜蓿的第3年固氮作用開始體現(xiàn)，隨著種植年限的延長苜蓿的固氮量增加[23]。紫花苜蓿種植前5 a為土壤全氮增長期，之后土壤全氮含量就開始降低，總體呈現(xiàn)出周期變化[24]。邰繼承等[25]研究認為土壤全氮含量因苜蓿種植年限的延長而逐漸增加，但其增長率是隨著年限的增加而降低的。徐艷霞等[26]研究認為，苜蓿草地土壤氮素含量在生長旺盛期呈下降趨勢，在衰敗期呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。這些在特定的氣候條件和土壤條件下得出的結(jié)論表明，氣候和土壤質(zhì)地等環(huán)境條件不同，種植年限對苜蓿草地土壤氮素的影響也不盡相同，但這些研究均未從影響土壤氮素循環(huán)轉(zhuǎn)化的微生物角度進行探討。因此，本研究以生長旺盛期(L2012)和衰退期(L2005和L2003)的紫花苜蓿為研究對象，通過探討苜蓿由盛轉(zhuǎn)衰后其土壤全氮、硝(銨)態(tài)氮、硝化潛勢以及氨氧化微生物豐度的變化趨勢，以期明確種植年限對影響土壤氮素轉(zhuǎn)化的微生物學機制，亦可為黃土高原苜蓿適宜種植年限的確定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗設置在甘肅省定西市李家堡鎮(zhèn)麻子川村的甘肅農(nóng)業(yè)大學旱作農(nóng)業(yè)綜合試驗站(104°44′ E，35°27′ N)，于2012年實施。該站地處黃土高原中部，屬于典型的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，年均太陽輻射592.9 kJ·cm-2，全年光照2 476.6 h，年均氣溫6.4℃，≥0℃年積溫2 933.5℃，≥10℃年積溫2 239.1℃；無霜期140 d，年均降水400 mm，年蒸發(fā)量1 531 mm。土壤類型為黃綿土。土壤容重(BD)、有機碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)及pH值等基礎理化性質(zhì)見表1。

1.2 試驗設計

所選品種為當?shù)貍鹘y(tǒng)品種隴東苜蓿，試驗共設3個處理，分別為2003年(L2003)、2005年(L2005)、2012年(L2012)建植的紫花苜蓿，各小區(qū)面積均為3 m×7 m=21 m2，3次重復，種植期間未施肥灌水，各處理田間管理保持一致，每年刈割2次(6月和9月)。

1.3 土壤樣品采集

于2018年5月20日，采集苜蓿頭茬花期0～30 cm土層土壤，各小區(qū)均采用傳統(tǒng)五點取樣法采集土壤樣品，將樣品混勻后，裝入滅菌自封袋，干冰保存，及時帶回實驗室，將土樣分為3部分，一部分放入-80℃冰箱用于氨氧化微生物豐度的測定，一部分鮮土保存在4℃冰箱中，測定硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量及硝化潛勢，剩余土樣風干后測定土壤全氮含量。

1.4 指標測定

1.4.2 土壤硝化潛勢的測定 土壤硝化潛勢(Nitrification potential,NP)測定采用氯酸鹽抑制法[19]。稱取5 g鮮土并加入20 mL含1 mM (NH4)2SO4的磷酸鹽緩沖液，并加入少量0.2 mol·L-1KClO3溶液，抑制亞硝酸鹽的氧化；將其放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)24 h后，加入10 mL的2 mol·L-1KCl溶液浸提土壤并震蕩1 h，過濾，濾液用來測定亞硝態(tài)氮含量，顯色劑為N- (1-萘基) -乙二胺，用紫外分光光度計于540 nm波長下測定，單位時間內(nèi)土壤中增加的亞硝態(tài)氮含量即為硝化潛勢。

1.4.3 氨氧化微生物豐度的測定 由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行氨氧化微生物豐度測定，共使用2對引物Arch-amoAF/Arch-amoAR[27]和AmoA-1F/AmoA-2R[28]，如表2，PCR 采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase，PCR儀為ABI7500 型熒光定量 PCR 儀。PCR反應體系(20 μL)：2×PCR mix 10 μL，上、下游引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL，模板1 μL，補足dd無菌H2O至20 μL。PCR反應條件：預變性，95℃，5 min；變性，95℃，45 s；退火，58℃(AOA)，60℃(AOB)，30 s；延伸，72℃，1 min，35個循環(huán)。完成上述步驟后，把加好樣本的96孔板放在ABI 7500型熒光定量PCR儀中進行反應。共設3個平行實驗，以無菌水為空白陰性對照。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)整理及作圖用Excel 2010完成，顯著性差異和相關(guān)性分析采用SPSS 22.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同苜蓿種植年限對土壤硝化潛勢的影響

硝化作用將氨氧化成亞硝態(tài)氮以及硝態(tài)氮,硝化潛勢可表征其硝化速率。不同種植年限苜蓿土壤硝化潛勢如圖1所示。種植年限顯著影響苜蓿土壤的硝化潛勢，L2012處理土壤硝化潛勢最高，為0.05 μg·g-1·h-1，隨苜蓿種植年限延長，土壤硝化潛勢逐漸降低。統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，L2012處理硝化潛勢顯著高于L2003和L2005處理(P<0.05)，增幅達25%。

表1 土壤基礎理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties

表2 目標基因的引物名稱及引物序列

2.2 不同苜蓿種植年限對土壤全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的影響

不同種植年限苜蓿土壤全氮、硝態(tài)氮及銨態(tài)氮含量如表3。延長苜蓿種植年限可以提高表層土壤中的全氮及硝態(tài)氮含量，且隨苜蓿種植時間延長，土壤全氮、硝態(tài)氮差異顯著。其中L2003處理和L2005處理土壤全氮含量顯著高于L2012處理(P<0.05)，分別高15.69%和11.76%；L2003處理和L2005處理硝態(tài)氮含量較L2012處理增加59.73%和33.62%。土壤銨態(tài)氮則對苜蓿種植年限沒有明顯的響應。

2.3 不同苜蓿種植年限對氨氧化微生物豐度的影響

不同種植年限苜蓿土壤中AOA基因拷貝數(shù)為9.75×106～12.68×106個·g-1，AOB基因拷貝數(shù)為5.01×106～7.70×106個·g-1，且各處理中AOA豐度均高于AOB(圖2)。在表層土壤中，AOA豐度隨種植年限延長顯著增加(P<0.05)，L2003和L2005處理AOA豐度較L2012處理分別增加30.26%和22.05%；AOB豐度隨苜蓿種植年限延長先升高后降低，L2005處理AOB基因拷貝數(shù)顯著高于L2003處理和L2012處理(P<0.05)，增幅分別為44.74%和53.69%；AOA∶AOB的比值為1.55～2.38，呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢。綜合來看，隨著苜蓿種植年限的增加，AOA和AOB的豐度均呈增加趨勢，其比值呈現(xiàn)出先降低后增加的變化趨勢。

注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note: Different letter represent significant differences among treatments (P<0.05).圖1 不同苜蓿種植年限對土壤硝化潛勢的影響Fig.1 Effects of different alfalfa planting years onsoil potential nitrification rate

2.4 土壤氨氧化微生物豐度與氮素、硝化潛勢的相關(guān)性分析

土壤氨氧化微生物豐度與氮素、硝化潛勢的相關(guān)分析表明(表4)，氨氧化古菌(AOA)豐度受到土壤硝化潛勢(r=-0.802)、全氮(r=0.853)和硝態(tài)氮含量(r=0.833)共同影響，其中土壤硝化潛勢與全氮含量、AOA豐度呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與土壤硝態(tài)氮呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；土壤全氮與AOA豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與硝態(tài)氮含量具有顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；氨氧化細菌(AOB)豐度與土壤理化性質(zhì)沒有明顯的相關(guān)性。

表3 不同苜蓿種植年限對土壤全氮和硝、銨態(tài)氮的影響

注：同一指標不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters in the same index indicate significant differences among treatments (P<0.05).圖2 不同苜蓿種植年限對土壤AOA和AOB豐度的影響Fig.2 Effects of different alfalfa planting years onsoil AOA and AOB abundance

表4 土壤氨氧化微生物豐度與土壤氮素、硝化潛勢相關(guān)分析

3 討 論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，在土壤物質(zhì)循環(huán)、有機物的合成和分解、土壤質(zhì)量改善、土壤肥力的提升以及作物的生長和病蟲害防治等方面均發(fā)揮重要的作用[35]。氨氧化微生物是參與硝化作用的最主要微生物，是硝化過程的第一步，也是限速步驟，其豐度與氮素形態(tài)及土壤pH顯著相關(guān)[9,12,15]。北方堿性土壤中，氨氧化細菌是硝化作用的主要驅(qū)動者，而南方酸性土壤中，硝化作用則主要由氨氧化古菌主導[36-38]。這些結(jié)果一致證實了AOA和AOB生態(tài)位分異的特征，AOB傾向于在高氮pH值中性或堿性的環(huán)境中起主導作用，而AOA則更適宜于在酸性及低氮高的土壤中占主導優(yōu)勢[39-40]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，黃土高原半干旱雨養(yǎng)區(qū)苜蓿土壤AOA豐度顯著高于AOB，說明由于土壤低氮環(huán)境使得AOA演變?yōu)閮?yōu)勢類群。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，硝化潛勢和AOA豐度呈顯著負相關(guān)，而與AOB并無明顯相關(guān)關(guān)系。這表明黃綿土區(qū)苜蓿土壤硝化潛勢變化與氨氧化微生物豐度變化并不一致，也說明氨氧化微生物群落豐度與其活性之間存在不一致的關(guān)系。據(jù)此可以推斷，除了AOB和AOA這2類半程氨氧化微生物之外，還存在其他類型的氨氧化微生物主導著黃綿土區(qū)苜蓿土壤的硝化過程，因為已有研究發(fā)現(xiàn)，屬于硝化螺菌門譜系Ⅱ的全程氨氧化微生物(Comammox)廣泛分布于農(nóng)業(yè)土壤、森林土壤、稻田水域、淡水等自然環(huán)境中，其對底物NH3的親和力遠高于大多數(shù)可培養(yǎng)的AOA物種，能夠更好地適應極低 NH3濃度的脅迫環(huán)境[41]。

4 結(jié) 論

黃土高原半干旱區(qū)長期種植苜蓿后，土壤氨氧化古菌(AOA)數(shù)量顯著高于氨氧化細菌(AOB)，土壤氮素含量顯著影響AOA豐度，這表明黃土高原半干旱區(qū)苜蓿土壤氨氧化微生物AOA占主導地位，且對長期種植苜蓿后土壤理化性質(zhì)的改變更為敏感。種植苜蓿會增加土壤氮素含量，年限顯著影響著土壤硝化潛勢。但是，土壤硝化潛勢由于受多種環(huán)境因子的調(diào)控，相關(guān)分析結(jié)果并不能確定主導土壤硝化作用的優(yōu)勢微生物類群。