湛潤(rùn)生，王 莉，岳新麗，田宏先，王瑞霞

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008)

長(zhǎng)期以來(lái)，隨著人類社會(huì)的生產(chǎn)活動(dòng)，土壤重金屬逐年累積。重金屬對(duì)于土壤來(lái)說(shuō)是一種不可逆性的污染物，在土壤中很難被降解，并通過(guò)食物鏈傳遞，最終在人體內(nèi)累積[1]。鎘(Cd)是一種對(duì)動(dòng)植物都有毒害作用的非必需重金屬元素,被鎘污染的土壤有隱蔽性、長(zhǎng)期性和不可逆性等特點(diǎn)。Cd在進(jìn)入植物體后，極易在體內(nèi)富集，會(huì)影響植物的各項(xiàng)生理指標(biāo)，延緩植物生長(zhǎng)，甚至?xí)怪参锼劳鯷2]。

在眾多的重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)中，利用超富集植物修復(fù)重金屬污染土壤，操作簡(jiǎn)單、成本低、效果明顯，且不會(huì)引起二次污染[3]。芥菜型油菜(BrassicajunceaL.)十字花科蕓薹屬植物，一、二年生草本，高30～90 cm，種子含油量約40%，在全國(guó)各地均有種植，是國(guó)內(nèi)主要油料作物之一。芥菜型油菜與印度芥菜同屬于十字花科蕓薹屬植物，后者對(duì)特定的重金屬具有超積累作用，經(jīng)常被作為植物土壤修復(fù)引進(jìn)的植物，進(jìn)一步研究表明芥菜型油菜同樣具有重金屬超累積功能，可以用于土壤重金屬污染治理[4,5]。在種子植物整個(gè)生活史中，早期種子萌發(fā)和幼苗階段是其一生中最脆弱的階段，易受外界環(huán)境因素影響，死亡率較高，因此對(duì)種子萌芽和幼苗生理指標(biāo)的研究具有重要意義。本試驗(yàn)選用不同濃度的鎘處理油菜種子及幼苗，探討Cd2+脅迫下對(duì)油菜種子萌發(fā)、植株光合作用、膜系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)等方面進(jìn)行研究，進(jìn)而討論Cd2+對(duì)植物的損傷機(jī)理，也為利用芥菜型油菜修復(fù)重金屬污染土壤的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

晉油12號(hào)由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所提供，該品種適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱、抗蟲害、不易倒、產(chǎn)量高、品質(zhì)好，是由9212-2(♀)和晉油6號(hào)(♂)雜交育種而成，屬于中晚熟品種，生長(zhǎng)期95 d左右，適宜在晉北和晉西北地區(qū)種植[6]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Cd2+對(duì)種子萌發(fā)的影響

選取油菜種子若干，用沉降法選取顆粒飽滿的種子，用75%的乙醇消毒30 min，然后沖洗掉表面的殘留物，在放有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)放15粒種子，設(shè)置5個(gè)不同濃度的Cd2+(0、5 mg·L-1、10 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1)溶液進(jìn)行處理，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)期間保持濾紙濕潤(rùn)，每天觀察種子的發(fā)芽情況以及培養(yǎng)皿內(nèi)的水分流失情況，每12 h添加相應(yīng)溶液保持培養(yǎng)皿內(nèi)水分供應(yīng)充足。用陳花等[7]的方法測(cè)定發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標(biāo)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(3 d內(nèi)的發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā) 芽 率(%)=(7 d內(nèi)的發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)；

活力指數(shù)=S×∑(Gt/Dt)。

其中Gt是t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)；S為胚根鮮重，以每皿胚根的總重計(jì)算。

1.2.2Cd2+對(duì)油菜幼苗生理指標(biāo)的影響

將晉油12號(hào)籽粒播種在5×10的穴盤中，期間保持營(yíng)養(yǎng)土濕潤(rùn)。待幼苗長(zhǎng)到3葉期，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，平均分成5組，用去離子水洗凈根部。同時(shí)在試管中加入不同濃度的Cd2+培養(yǎng)液，以蒸餾水為對(duì)照，然后將油菜苗放進(jìn)試管中，以露出莖上部為宜，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將試管置于光照培養(yǎng)箱中，每日光照12 h，溫度25 ℃下培養(yǎng)。同時(shí)每12 h用震蕩培養(yǎng)箱搖瓶5～10 min，保證試管內(nèi)氧氣充足。2 d后，將幼苗從試管中取出，用蒸餾水反復(fù)沖洗，將表面的鎘離子全部沖洗干凈，濾紙吸干油菜幼苗表面的水分，將其葉子剪碎用于測(cè)定以下指標(biāo)。

參照李合生[8]的實(shí)驗(yàn)方法，測(cè)定以下指標(biāo)：分光光度計(jì)法測(cè)葉綠素含量；硫代巴比妥酸處理，紫外分光光度計(jì)測(cè)定丙二醛(MDA)含量；高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對(duì)油菜種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，對(duì)照處理發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為85.71%和80%，5 mg·L-1Cd2+濃度處理時(shí)，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率分別較對(duì)照增加了7.14%和6.67%。隨著處理Cd2+濃度的升高，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率逐漸降低，濃度越高下降越明顯，50 mg·L-1Cd2+濃度時(shí)，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率達(dá)到最低，僅為對(duì)照的66.67%。

圖1 Cd2+脅迫對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

從圖2可以看出，晉油12號(hào)的發(fā)芽指數(shù)隨Cd2+濃度增加呈先小幅度上升后逐漸下降的趨勢(shì)。經(jīng)5 mg·L-1Cd2+濃度處理，種子發(fā)芽指數(shù)(5.571)比對(duì)照增加0.428，50 mg·L-1Cd2+濃度處理發(fā)芽指數(shù)最低(3.429)。說(shuō)明低濃度的Cd2+對(duì)油菜種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，高濃度Cd2+抑制種子萌發(fā)?；盍χ笖?shù)則隨著處理Cd2+濃度的升高而逐漸下降，說(shuō)明Cd2+對(duì)胚根的生長(zhǎng)有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Cd2+處理后，種子根部發(fā)生不同程度的發(fā)黃發(fā)黑現(xiàn)象，部分植物根部發(fā)黑導(dǎo)致植株死亡。

圖2 Cd2+脅迫對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

2.2 不同濃度的Cd2+處理對(duì)油菜幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1不同濃度Cd2+處理對(duì)葉綠素含量的影響

從圖3可以看出，經(jīng)Cd2+處理的油菜幼苗體內(nèi)葉綠素含量均低于對(duì)照，并且葉綠素a、葉綠素總含量和類胡蘿卜素的含量均隨著Cd2+濃度的升高而逐漸降低。試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Cd2+處理的幼苗，葉片呈不同程度的發(fā)黃、卷曲，且濃度越高越嚴(yán)重；整體表現(xiàn)為植株矮小，葉片面積小。

圖3 Cd2+脅迫對(duì)油菜幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2不同濃度Cd2+處理對(duì)MDA含量的影響

從圖4可以看出，對(duì)照組油菜幼苗單位鮮重MDA含量為11.08 μmol·g-1；5 mg·L-1Cd2+濃度處理時(shí)，MDA含量較對(duì)照降低了3.90 μmol·g-1；10 mg·L-1Cd2+濃度處理時(shí)，MDA含量較對(duì)照降低1.88 μmol·g-1；25 mg·L-1Cd2+濃度處理時(shí)，幼苗MDA含量較對(duì)照增加0.48 μmol·g-1；50 mg·L-1Cd2+濃度處理時(shí)，其含量比對(duì)照增加4.71 μmol·g-1。隨著Cd2+處理濃度的升高，油菜幼苗單位鮮重MDA含量整體呈先降低后升高的趨勢(shì)。

圖4 Cd2+脅迫對(duì)油菜幼苗MDA含量的影響

2.2.3不同濃度的Cd2+對(duì)CAT活性的影響

由圖5可見(jiàn)，當(dāng)Cd2+濃度為5 mg·L-1、10 mg·L-1時(shí)，CAT活性分別比對(duì)照降低了3.03 mg·(g·min)-1和2.95 mg·(g·min)-1；25 mg·L-1Cd2+濃度時(shí)，CAT活性最高，為13.99 mg·(g·min)-1；50 mg·L-1Cd2+濃度時(shí)，CAT活性為10.10 mg·(g·min)-1，比25 mg·L-1Cd2+濃度時(shí)下降了3.89 mg·(g·min)-1?？傮w來(lái)看，隨著Cd2+濃度的升高，CAT活性整體呈下降-升高-下降的趨勢(shì)。

圖5 Cd2+脅迫對(duì)油菜幼苗CAT活性的影響

3 討 論

隨著Cd2+濃度的升高，除活力指數(shù)外，種子萌發(fā)各項(xiàng)指標(biāo)均呈先小幅升高后逐漸降低的趨勢(shì)，5 mg·L-1Cd2+濃度時(shí),種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最大值，這一結(jié)論與鄭本川等[9]的研究結(jié)果一致。大量研究表明，低濃度Cd2+脅迫對(duì)油菜種子發(fā)芽有一定的促進(jìn)作用，隨著重金屬處理濃度的升高，植株中蓄積量越多，種子萌發(fā)相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)下降愈加明顯，對(duì)植物的毒害作用也越強(qiáng)。

葉綠素是反映植物光合作用的重要指標(biāo)之一，葉綠素含量高低可以反映出植物遭受毒害的程度。Cd2+對(duì)晉油12號(hào)的光合作用影響較大，Cd2+處理濃度越高，葉綠素含量愈低，光合系統(tǒng)被破壞程度越高。在形態(tài)上表現(xiàn)為葉片褪綠、發(fā)黃、延展性變?nèi)?，葉面積變小，葉邊緣略微卷曲，而葉片發(fā)黃是植物在遭受脅迫后的普遍現(xiàn)象。葉綠素含量降低的原因多樣，可能因?yàn)镃d2+干擾有關(guān)葉綠素合成酶的活性，使葉綠素合成受阻；同時(shí)，增加了葉綠素酶的活性，使葉綠素分解，最終表現(xiàn)為凈含量減少[10]。

抗氧化防御系統(tǒng)在近年來(lái)已作為反映分子生態(tài)毒理的指標(biāo)，其中氧化自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在生物新陳代謝中至關(guān)重要，它們維持著相對(duì)平衡。當(dāng)機(jī)體損傷時(shí)，平衡遭到破壞，發(fā)生一系列連鎖反應(yīng)，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA， 因此MDA含量通常被作為判斷膜脂過(guò)氧化作用的指標(biāo)[11]。在本試驗(yàn)中，MDA含量隨著Cd2+濃度的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)。具體表現(xiàn)為植物在受低濃度的Cd2+脅迫下，MDA含量較對(duì)照低，說(shuō)明膜脂過(guò)氧化作用減弱，植物的新陳代謝速率減慢；當(dāng)Cd2+濃度升高后，植物所受的脅迫加重，MDA含量明顯高于對(duì)照，膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，膜受害程度加重，給植物組織細(xì)胞帶來(lái)了極大的損傷。目前關(guān)于重金屬損害植物的機(jī)制，徐楠研究認(rèn)為，當(dāng)植物吸收大量重金屬離子時(shí)，會(huì)破壞其組織內(nèi)的離子平衡，使植物在吸收利用離子時(shí)造成困難，從而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育[12]。在低濃度重金屬離子的脅迫下，植物組織內(nèi)的保護(hù)酶活性提高，以此消除H2O2過(guò)多造成的影響，從而維護(hù)膜系統(tǒng)的平衡；而在高濃度離子的脅迫下，保護(hù)酶活性降低，細(xì)胞膜受損，產(chǎn)生了MDA等膜脂過(guò)氧化物，使細(xì)胞膜進(jìn)一步受到損傷。劉春艷研究表明，重金屬可能會(huì)與膜表面的巰基結(jié)合，破壞膜的結(jié)構(gòu)，影響膜功能，使各細(xì)胞器受損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液外滲[13]。在分子水平上，重金屬還會(huì)破壞DNA和RNA的結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

過(guò)氧化氫酶(CAT)是植物內(nèi)的抗氧化物保護(hù)酶之一。CAT在植物逆境生理、生物應(yīng)答等方面有著極其重要的作用，它會(huì)清除植物體產(chǎn)生的H2O2。植物在遭受到重金屬脅迫后，植物的抗氧化系統(tǒng)也會(huì)受到不同程度的損傷[14]。試驗(yàn)中低濃度Cd2+處理時(shí)，CAT活性受到抑制，說(shuō)明晉油12號(hào)可能對(duì)Cd2+較為敏感；而在25 mg·L-1時(shí)，CAT活性急劇升高，植物的抗氧化能力增強(qiáng)；在50 mg·L-1處理下，較25 mg·L-1處理酶活性水平下降，造成植物內(nèi)H2O2積累，此時(shí)Cd2+破壞了植物的保護(hù)系統(tǒng)。徐楠[12]、劉春艷等[13]認(rèn)為，CAT對(duì)Cd2+較為敏感，隨著Cd2+濃度的升高，酶活力下降迅速。周希琴等[15]研究表明，重金屬Cd2+還會(huì)對(duì)植物的可溶性糖和蛋白質(zhì)含量造成不同程度的影響，關(guān)于晉油12號(hào)的表現(xiàn)有待深入研究。

4 結(jié) 論

重金屬對(duì)植物生理生化過(guò)程的損傷研究近些年有很多報(bào)道。本研究表明，鎘脅迫后晉油12號(hào)種子發(fā)芽指標(biāo)、幼苗生理指標(biāo)如葉綠素、MDA含量以及CAT活性都有所變化，影響到種子萌發(fā)、植株光合作用、膜系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)等生理生化過(guò)程，但是關(guān)于鎘對(duì)其他品種油菜的影響有待進(jìn)一步研究。