郭文凱,孫慶文,張磊超,祝久潔,華 萃
(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽(yáng) 550025)
輪鐘花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh) Kurz),別名紅果參、山荸薺、蜘蛛果、算盤果等[1,3,4],為桔梗科(Campanulaceae)植物,曾作為金錢豹屬(Campanumoea)植物長(zhǎng)葉輪鐘草(Campanumoealancifolia(Roxb.) Merr.)收載于《中國(guó)植物志》(1983)中[1],現(xiàn)2013版《Flora of China》中記載為輪鐘花屬(Cyclocodon)植物[2]。輪鐘花以根入藥,具有益氣補(bǔ)虛、祛瘀止痛之效,主要用于氣虛乏力、跌打損傷,常用于治療肺癆咳嗽、瘰疬、疝氣等[4]。輪鐘花不但根具有較高的藥用價(jià)值而且果實(shí)味道十分鮮美,具有生物活性的粗多糖含量豐富,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,民間常被作為水果食用[5]。目前對(duì)輪鐘花植物的研究方向主要集中于化學(xué)成分、藥理、生藥鑒別[6-11]等?;瘜W(xué)及藥理研究表明,輪鐘花含有糖類、黃酮類、果膠類以及揮發(fā)油等化學(xué)成分,具有較高的抗氧化能力。輪鐘花無(wú)論作為藥材還是水果,均具有廣闊的開發(fā)利用前景[12-15]。
近年來(lái),隨著關(guān)注程度增加,市場(chǎng)需求不斷攀升,野生資源銳減,已不能滿足市場(chǎng)需求,開展人工種植勢(shì)在必行。因此為進(jìn)一步了解輪鐘花種子的生物學(xué)特性,以種子為材料,對(duì)其萌發(fā)特性進(jìn)行系統(tǒng)研究,以期為其種子育苗、規(guī)模化種植提供參考。
試驗(yàn)材料于2017年12月采自貴州中醫(yī)藥大學(xué)“國(guó)家基本藥物所需中藥材種子種苗繁育(貴州)基地”,并經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為輪鐘花(Cyclocodonlancifolius(Roxburgh) Kurz)的種子。
1.2.1儀 器
ZPZ-300智能低溫低濕樣品箱(杭州錢江儀器設(shè)備有限公司);SZN型體視顯微鏡(浙江托普儀器有限公司);MvImage vt應(yīng)用系統(tǒng);AG 135型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);GZX-9070電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);RTOP系列智能人工氣候培養(yǎng)箱(浙江托普儀器有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。
1.2.2試 藥
次氯酸鈉(NaClO)(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);赤霉素(GA3)(廣州市林國(guó)化肥有限公司);氯化鈉(NaCl)(上海山浦化工有限公司);超純水。
1.3.1消毒處理
種子消毒:將供試輪鐘花種子浸泡于2% NaClO溶液中5 min,取出后純凈水沖洗3次。
儀器消毒:將試驗(yàn)所用的培養(yǎng)皿、燒杯、鑷子等工具121 ℃滅菌1.5 h。
1.3.2浸種時(shí)間處理
將消毒后的種子置于超純水中,分別浸泡0.5、1、6、12、24、36、48 h,取出后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.3鹽分處理
將消毒后的種子置于0(ck)、5、15、20、25、30 mg·mL-1的NaCl溶液中浸種1 h,取出后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.4GA3處理
將消毒后的種子置于0(ck)、200、400、600、800、1 000、1 200 mg·L-1的GA3溶液浸種24 h,取出后使用純凈水沖洗并置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.5發(fā)芽床的設(shè)定
將消毒后的種子置于濾紙(雙層濾紙)、紗布(雙層紗布)、脫脂棉、河沙及草炭土5個(gè)不同的發(fā)芽床上,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.6溫度的設(shè)定
設(shè)15、20、25、30、35 ℃ 5個(gè)梯度溫度,將消毒后的種子置于該恒溫梯度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.7光照時(shí)間的設(shè)定
設(shè)黑暗、光照12 h·d-1(66%光照強(qiáng)度)與光照24 h·d-1(66%光照強(qiáng)度)3個(gè)不同的光照條件,將消毒后的種子置于該光照條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.8光照強(qiáng)度的設(shè)定
設(shè)置33%(4 950 lx)、66%(9 900 lx)、自然光(10 000 lx)與99%(15 000 lx)等4種光照強(qiáng)度,光照時(shí)間為12 h·d-1,將消毒后的種子置于該光照強(qiáng)度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
依據(jù)上述試驗(yàn)篩選出的最佳萌發(fā)條件,將消毒后的種子置于此條件下培養(yǎng),觀察種子的發(fā)芽狀況。
由于輪鐘花種子發(fā)芽時(shí)間較長(zhǎng),所以在發(fā)芽試驗(yàn)開始后的第7天計(jì)算發(fā)芽勢(shì),第24天計(jì)算發(fā)芽率。在以河沙和草炭土為發(fā)芽床的試驗(yàn)中,種子發(fā)芽初期不易觀察,故在第9天統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽勢(shì)。本試驗(yàn)中,除發(fā)芽床條件外,其余種子發(fā)芽培養(yǎng)均采用TP法(雙層濾紙),試驗(yàn)中定期澆水,保持發(fā)芽床濕潤(rùn)且無(wú)積水,定期記錄種子的發(fā)芽情況。上述試驗(yàn)中每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50粒種子。
采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan法進(jìn)行多重比較,采用Origin 2017軟件進(jìn)行作圖。
發(fā)芽率(%)=(24 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%[16];
發(fā)芽勢(shì)(%)=(7 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。
由圖1可知,在浸種時(shí)間為36~48 h時(shí),初始發(fā)芽天數(shù)為4 d,低于36 h則初始發(fā)芽天數(shù)為6 d,但無(wú)論浸種時(shí)間長(zhǎng)短,輪鐘花種子發(fā)芽率較為整齊,大部分均在同一時(shí)間達(dá)到65%以上,其中浸種36 h在第8天達(dá)到發(fā)芽率最大值(100%),其他浸種時(shí)間均在12 d后開始達(dá)到最大值。
圖1 不同浸種時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的影響
不同浸種時(shí)間段之間發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均具有顯著性差異(p<0.05)(表1),且隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。浸種時(shí)間為0.5 h時(shí),種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率最低,其中發(fā)芽勢(shì)顯著低于浸種1~48 h(p<0.05),極顯著低于浸種6~36 h(p<0.01);而浸種時(shí)間為36 h時(shí),發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均達(dá)到最高水平,但僅與部分處理組間差異達(dá)到顯著水平。綜合初始發(fā)芽天數(shù)與發(fā)芽勢(shì)大小,認(rèn)為輪鐘花種子的浸種時(shí)間以36 h為宜。
表1 不同浸種時(shí)間對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
由圖2可知,不同濃度鹽分的初始發(fā)芽天數(shù)均為6 d,且發(fā)芽率較為整齊,均在同一時(shí)間達(dá)到50%以上。當(dāng)鹽分濃度為0時(shí),發(fā)芽率最小(96.67%),當(dāng)鹽分濃度為5 mg·mL-1時(shí),發(fā)芽率達(dá)到最大值(99.33%)。
圖2 不同濃度鹽處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響
不同濃度的鹽處理對(duì)輪鐘花種子有一定的影響(表2)。當(dāng)鹽分濃度為0~5 mg·mL-1時(shí),發(fā)芽率呈上升趨勢(shì);鹽分濃度為5~30 mg·mL-1時(shí),發(fā)芽率略呈下降趨勢(shì),但差異均未達(dá)到顯著水平(p≥0.05);對(duì)比發(fā)芽勢(shì)可知,空白處理的發(fā)芽勢(shì)為最大值(90.67%)且較5 mg·mL-1和15~25 mg·mL-1鹽分處理有顯著性差異(p<0.05)。綜合以上表明,輪鐘花種子具有一定耐鹽分脅迫能力。
表2 不同濃度的鹽處理對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
由圖3可看出,除ck的初始發(fā)芽天數(shù)為4 d外,其余均為5 d,且發(fā)芽率較為整齊,均在同一時(shí)間達(dá)到54%以上。由表3可知,隨著GA3濃度增加,種子發(fā)芽率隨之降低,當(dāng)濃度增加至400 mg·L-1時(shí),發(fā)芽率趨于穩(wěn)定,當(dāng)濃度增至800 mg·L-1后,種子發(fā)芽率有所下降。經(jīng)方差分析可知,200 mg·L-1GA3的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)顯著低于其他處理組(p<0.05),ck發(fā)芽率高于其它處理組,但差異均未達(dá)到顯著水平(除200 mg·L-1)。由初始發(fā)芽天數(shù)、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率可知,輪鐘花種子無(wú)需GA3處理即可達(dá)到較好的萌發(fā)效果。
圖3 不同濃度GA3對(duì)種子發(fā)芽率的影響
由圖4可知,濾紙、紗布與脫脂棉的初始發(fā)芽天數(shù)較河沙與草炭土提前2 d,在不同的發(fā)芽床上其發(fā)芽率不整齊,在初始發(fā)芽天數(shù)只有濾紙發(fā)芽率超過(guò)65%,而脫脂棉則在1周內(nèi)達(dá)到最大發(fā)芽率,河沙雖然發(fā)芽較遲,但其發(fā)芽率最高,為99.33%。5種發(fā)芽床的發(fā)芽率大小排序?yàn)楹由?紗布>濾紙=脫脂棉>草炭土。
以草炭土為發(fā)芽床的發(fā)芽率顯著低于濾紙、紗布、脫脂棉和河沙(p<0.05),而濾紙、紗布、脫脂棉和河沙之間差異均不顯著(p≥0.05)。由發(fā)芽勢(shì)可知,草炭土與濾紙、河沙、紗布、脫脂棉有極顯著差異(p<0.01),濾紙顯著高于河沙、紗布、脫脂棉(p<0.05)。故輪鐘花種子的最佳發(fā)芽床為河沙(表4)。
表3 不同濃度的GA3處理對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
表4 不同發(fā)芽床對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
圖4 不同發(fā)芽床對(duì)種子發(fā)芽率的影響
在發(fā)芽溫度為15 ℃時(shí),初始發(fā)芽天數(shù)為12 d,發(fā)芽率僅為17.33%;在20 ℃溫度下初始發(fā)芽天數(shù)為7 d,但發(fā)芽率僅為16.67%;在25 ℃下種子的初始發(fā)芽天數(shù)最短,為6 d且發(fā)芽率已達(dá)66.67%;在30 ℃時(shí),初始發(fā)芽天數(shù)為10 d,且發(fā)芽率極低,僅為2.00%;在35 ℃時(shí),種子無(wú)萌發(fā)跡象。對(duì)比發(fā)芽率排序?yàn)?5 ℃=20 ℃>25 ℃>30 ℃>35 ℃(圖5)。
由溫度為35 ℃對(duì)種子發(fā)芽率的影響與15~30 ℃之間有極顯著性差異(p<0.01),而30 ℃與15~25 ℃之間有顯著性差異(p<0.05),15~25 ℃之間發(fā)芽率較高但無(wú)顯著性差異(p≥0.05);對(duì)比發(fā)芽勢(shì)可知,25 ℃、20 ℃與其他溫度之間有極顯著性差異(p<0.01),25 ℃與20 ℃之間也有極顯著差異(p<0.01),且發(fā)芽勢(shì)最好的為25 ℃條件下,其余溫度的發(fā)芽勢(shì)均較差。綜合發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率認(rèn)為,輪鐘花種子萌發(fā)的最適溫度為25 ℃(表5)。
表5 不同溫度對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
圖5 不同溫度對(duì)種子發(fā)芽率的影響
由圖6可知,在黑暗條件下,種子初始發(fā)芽天數(shù)為14 d,發(fā)芽勢(shì)為0,發(fā)芽率極低(2.67%);在光照條件下,種子發(fā)芽率明顯優(yōu)于黑暗條件,但無(wú)論光照時(shí)長(zhǎng)如何改變,種子的發(fā)芽情況無(wú)明顯變化,4種光照條件的發(fā)芽率大小排序?yàn)楣庹?4 h·d-1>光照12 h·d-1>黑暗。
圖6 不同光照條件對(duì)種子發(fā)芽率的影響
光照與否對(duì)種子的發(fā)芽有極顯著影響(p<0.01),但光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)均無(wú)顯著性影響(p≥0.05),由此可知,輪鐘花種子的發(fā)芽需要光照參與(表6)。
表6 不同光照條件對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
由圖7可看出,99%光照12 h·d-1初始發(fā)芽天數(shù)為5 d,但發(fā)芽率僅為6.00%,其余光照強(qiáng)度需要6 d,但發(fā)芽率較為整齊,均在同一時(shí)間達(dá)58%以上。4種光照強(qiáng)度下種子的發(fā)芽率大小排序?yàn)?9%光照12 h·d-1>自然光照12 h·d-1=33%光照12 h·d-1>66%光照12 h·d-1,但無(wú)顯著性差異(p≥0.05)。由表7可知,光照強(qiáng)度對(duì)種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)無(wú)顯著性影響(p≥0.05),輪鐘花種子的萌發(fā)僅需自然光照強(qiáng)度即可。
表7 不同光照強(qiáng)度對(duì)輪鐘花種子發(fā)芽狀況的影響
圖7 不同光照強(qiáng)度條件對(duì)種子發(fā)芽率的影響
依據(jù)上述試驗(yàn)篩選出最佳萌發(fā)條件:取種子浸泡于2% NaClO溶液中5 min,取出后超純水沖洗3次,再置于水中浸種36 h,取出后置于河沙上于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中自然光照培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),種子第6天開始萌發(fā),發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率分別為92.67%與98.00%,故本試驗(yàn)所篩選出的萌發(fā)條件可以使輪鐘花種子保持較高的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率。
浸種時(shí)間會(huì)影響種子的吸脹過(guò)程,改變種皮的軟化程度,從而使種子吸入更多的氧氣而促進(jìn)種子萌發(fā),但浸種時(shí)間過(guò)短,種子吸水不足,種胚內(nèi)部酶類等大分子物質(zhì)和細(xì)胞器活化較慢,影響種子萌發(fā),相反浸種時(shí)間過(guò)長(zhǎng),種子無(wú)氧呼吸嚴(yán)重,還會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),使細(xì)胞內(nèi)部水溶物外滲,同樣影響種子萌芽[17]。本試驗(yàn)表明,不同浸種時(shí)間段之間發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均具有顯著性差異(p<0.05)(表1),且隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì)。因輪鐘花的急劇吸水期為前8 h,故在本結(jié)果中前6 h隨著浸種時(shí)間的增加輪鐘花的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率呈增加趨勢(shì);穩(wěn)定吸水期為8~32 h,導(dǎo)致輪鐘花的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率在6~36 h時(shí)間段無(wú)顯著變化且達(dá)到最大值;32 h后雖為飽和吸水期,但浸種時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致輪鐘花的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率在36~48 h呈下降趨勢(shì)。表明輪鐘花種子的萌發(fā)需要通過(guò)浸泡種子來(lái)打破休眠,提高萌發(fā)效率。
鹽分對(duì)種子萌發(fā)的具有明顯的影響,主要原因?yàn)闈B透效應(yīng)和離子效應(yīng)。滲透效應(yīng)主要引起種子所處環(huán)境滲透勢(shì)降低而使種子吸水受阻,影響種子萌發(fā);離子效應(yīng)一方面直接造成毒害而抑制種子萌發(fā),另一方面則滲入種子,降低種子滲透勢(shì),加速吸水而促進(jìn)萌發(fā)[18]。本試驗(yàn)表明,輪鐘花種子在經(jīng)不同濃度鹽分浸泡1 h后,發(fā)芽率無(wú)明顯變化,發(fā)芽勢(shì)最大為對(duì)照組,導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能為:
1) 輪鐘花種子具有一定的耐鹽分能力;
2) 浸種時(shí)間不夠,導(dǎo)致鹽分還沒有滲入種子;
3) 鹽分濃度過(guò)高,導(dǎo)致種子所處環(huán)境滲透勢(shì)降低。
GA3是植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用的一種調(diào)節(jié)物質(zhì),特別在種子萌發(fā)過(guò)程中植物胚根突出階段,已有研究證明GA3溶液浸種可以打破種子休眠,消除ABA等物質(zhì)在種子萌發(fā)過(guò)程中的抑制作用,提高種子活力,促進(jìn)萌芽[19],本研究結(jié)果表明,輪鐘花種子無(wú)論使用何種濃度GA3溶液浸種,其發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率均低于空白對(duì)照組,故可認(rèn)為輪鐘花種子不存在休眠機(jī)制,無(wú)需GA3溶液浸種打破種子休眠。
溫度對(duì)種子萌發(fā)有著極其重要的作用,不同的溫度條件下,種子內(nèi)部的理化作用有所不同。一定程度的高溫并不是通過(guò)破壞種子活力來(lái)抑制種子萌發(fā),而是通過(guò)限制種子的其他內(nèi)源性因素,從而抑制種子萌發(fā)。
光照是某些種子萌發(fā)的必須條件,本試驗(yàn)將在黑暗條件下培養(yǎng)的已經(jīng)達(dá)到發(fā)芽終期的輪鐘花種子,移至光照條件下繼續(xù)培養(yǎng),7 d后發(fā)現(xiàn)其種子發(fā)芽率可以達(dá)到98.00%,仍具有活力(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。此結(jié)果進(jìn)一步表明,輪鐘花的種子萌發(fā)需要光照的參與,黑暗條件會(huì)抑制種子萌發(fā),但不會(huì)破壞種子活力,當(dāng)種子重新接受光照后,又能夠再次萌發(fā)。
種子的萌發(fā)是一個(gè)極其復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過(guò)程,主要取決于種子內(nèi)部的生理結(jié)構(gòu)與外部的環(huán)境條件,內(nèi)部的生理結(jié)構(gòu)主要包括2類:一類是內(nèi)源因素休眠,即胚的自身特性導(dǎo)致種子的休眠,包括胚發(fā)育不完全,缺少必須的激素刺激或萌發(fā)抑制物質(zhì)的存在;一類是外源因素休眠,即種子的結(jié)構(gòu)特征,包括種皮、胚乳、胚的附屬物等,導(dǎo)致種子受到機(jī)械阻礙,不透水、不透氣及萌發(fā)抑制物質(zhì)的限制。外部環(huán)境條件則主要包括溫度、水分、光照、鹽分、發(fā)芽床、氧氣等,外部環(huán)境的變化會(huì)直接影響種子內(nèi)部激素或萌發(fā)抑制物的分泌,或者直接導(dǎo)致種子失去活性[20],本研究主要研究了外部環(huán)境的變化及GA3激素處理對(duì)輪鐘花種子萌發(fā)的影響,為輪鐘花藥材的育苗、規(guī)?;N植等提供了一定理論依據(jù)。