金前躍，王寅彪，柴永笑，盧清俠，李 鵬，郭振華，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,7

(1.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農業(yè)科學院中英禽病國際研究中心，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動物重要疾病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 5.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100； 6.新鄉(xiāng)學院 生命科學技術學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；7.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，分為A、B、C、D、E等5個種，12個血清型(1～8a、8b～11)[1]。其中，FAdV-1型屬于A種，FAdV-5型屬于B種，FAdV-4型和FAdV-10型屬于C種，FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9、FAdV-11型屬于D種，FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b型屬于E種。FAdVs可感染雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉和鴕鳥等禽類群體，一般僅造成亞臨床癥狀，致病性較強的FAdVs可引起心包積水綜合征(HPS)、雞包涵體肝炎(IBH)和肌胃糜爛(GE)等[2-4]。HPS也稱為肝炎-心包積水綜合征(HHS)，主要由FAdV-4感染引起，剖檢可見淡黃色心包積液或心包內出現膠凍狀物質和嚴重的肝炎病變?；疾‰u常突然發(fā)病，迅速死亡，死亡率高達30%～70%[5]。FAdVs是無囊膜的雙股線性DNA病毒，基因組全長在40～46 kb，六鄰體(Hexon)蛋白是病毒表面含量最高的蛋白，富含主要的抗原決定簇，可用于FAdVs的基因分型[6-7]。

2014年以來，IBH和HPS病例在我國多個省份雞群中不斷出現且呈增加趨勢，對國內養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[8-9]。ZHAO等[9]從2013年采集的病雞樣品中首次分離到FAdV-4型病毒，命名為JSJ13株。同時，多項研究表明，國內當前流行的FAdV-4變異株感染是引起此次HPS疫情的主要原因[10-11]。與國外無毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比，國內流行的FAdV-4存在ORF19基因缺失，而且與JSJ13株相比，2015年以來分離的多株FAdV-4同時存在ORF29基因的部分缺失，這可能暗示國內的FAdV-4流行株在進一步適應禽類宿主[12-13]。河南省多個地市也出現了HPS疫情，流行病學調查顯示，5～11周齡雞群發(fā)病率較高，死亡率達30%～80%[14-15]。為明確FAdV-4河南流行株的基因組特征和分子進化關系，從新鄭某雞場采集了患有HPS的病雞樣品，通過盲傳分離FAdV毒株，并通過免疫熒光分析和PCR檢測確定分離毒株的血清型，對其進行全基因組序列分析和分子進化分析，以期為有效防控HPS暴發(fā)及FAdV感染在河南省的流行奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DME/F12培養(yǎng)基購自HyClone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自Solarbio公司；胎牛血清購自Gibco公司；Premix ExTaqDNA聚合酶、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)購自Takara公司；多聚甲醛、Triton X-100均購自國藥集團；FITC標記的羊抗鼠IgG購自北京博奧森；FAdV-4特異性單克隆抗體由河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院王江教授惠贈。

1.2 病料和細胞

患有HPS的病雞來源于河南省鄭州市(新鄭)某雞場。解剖后，收集心臟、肝臟、肺臟等組織，凍存于-40 ℃冰箱。雞肝癌細胞系(LMH)由本實驗室保存，利用含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3 病料的處理

無菌條件下取適量病料，以1∶3的質量體積比加入含青鏈霉素的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過濾上清液，凍存于-80 ℃。

1.4 病毒的分離

在LMH細胞匯合度約達到80%時，棄去培養(yǎng)基并用無菌PBS洗滌3次。使用無血清DME/F12培養(yǎng)基將上述處理后的病料研磨液稀釋50倍后接種于細胞上，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后通過-80 ℃與室溫間反復凍融，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。過濾后，再次接種于LMH細胞，盲傳3代以分離獲得病毒，并將其繼續(xù)傳至第11代以獲得穩(wěn)定毒株。

1.5 病毒的鑒定

1.5.1 細胞病變 制備LMH單細胞懸液并將其稀釋至約1.0×105個/mL，向96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入100 μL上述懸液于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細胞匯合度約為80%時，棄去培養(yǎng)基并使用無菌PBS洗滌后，向各孔中接種100 μL病毒液。孵育1.5 h后，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h觀察細胞病變。

1.5.2 免疫熒光檢測 按照1.5.1中的方法將盲傳獲得的病毒接種至LMH細胞，以未接毒的LMH細胞作為對照，24 h后，棄掉細胞上清，用預冷的PBS洗滌3次。使用4%多聚甲醛在室溫下固定細胞30 min，PBS洗滌2次，之后加入100 μL的0.1% Triton X-100室溫作用2 min，棄Triton X-100溶液，各孔加滿含5%脫脂奶粉的封閉液于4 ℃封閉過夜。PBS洗滌3次，加入抗FAdV-4的特異性單克隆抗體(1∶100)，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入FITC標記的羊抗鼠IgG (1∶100)，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入DAPI (1∶1 000)對核酸進行染色。然后再次洗滌，加入100 μL PBS防止干燥，并使用熒光顯微鏡觀察。

1.5.3 PCR檢測 根據FAdV-4 MX-SHP95毒株(GenBank登錄號：KP295475.1)的DNA聚合酶基因序列設計引物。PCR上游引物序列為5′-GCAGCGTGGTCTTGAAGATGGTTC-3′，下游引物序列為5′-CGCATTCAAGCCCGTTCGATTC-3′，預期擴增片段大小為632 bp。PCR反應條件：頂蓋溫度99 ℃，預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

1.5.4 全基因組測序 按照病毒基因組提取試劑盒說明，提取FAdV-4毒株的全基因組，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行全基因組二代測序。

1.6 分子進化分析

將分離株的全基因組序列和Hexon基因序列與GenBank中相關序列進行比對。利用MegAlign軟件的View/Sequence distance功能分析分離株與其他FAdV毒株的全基因組序列相似性，利用Mega 6.06軟件中的Clustal W程序完成分離株全基因組序列比對，并采用鄰接法構建遺傳進化樹，步長值(Bootstrap value)設置為1 000。利用DNAStar軟件對相關毒株的Hexon蛋白氨基酸序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 分離毒株細胞病變觀察

正常LMH細胞形態(tài)為梭形，呈單層貼壁生長(圖1A)。病料研磨液接種24 h后，部分細胞出現變圓的病變狀態(tài)(圖1B)；接種后48 h，幾乎所有的細胞都出現病變，呈葡萄串珠狀聚在一起(圖1C)；72 h后，病變的細胞大量脫落，部分細胞崩解，培養(yǎng)基變渾濁(圖1D)；說明分離的病毒能夠感染LMH細胞并產生明顯的細胞病變。

A:正常細胞; B:接種后24 h; C:接種后48 h; D:接種后72 hA:Normal cells; B:24 h after inoculation; C:48 h after inoculation; D:72 h after inoculation

2.2 分離毒株免疫熒光檢測結果

免疫熒光檢測結果表明，分離毒株感染LMH細胞24 h后，能在細胞質中觀察到綠色熒光信號，而對照組沒有熒光信號(圖2)，進一步說明病毒成功適應了LMH細胞，并獲得了良好增殖。

A:病毒感染的LMH細胞; B:未感染的LMH細胞A:Virus-infected LMH cells; B:Mock-infected LMH cells

2.3 分離毒株PCR鑒定結果

將處理過的病料研磨液接種LMH細胞，收集1～11代病毒液進行PCR檢測后，均擴增得到了632 bp大小的條帶(圖3)。表明成功分離了1株FAdV，命名為FAdV ZZ株。

M:DL2000 DNA Marker; 1—11:1～11代收集的病毒液; 12:陽性對照; 13:陰性對照M:DL2000 DNA Marker; 1—11:Virus from the different passages(1—11); 12:Positive control; 13:Negative control

2.4 分離毒株全基因組序列分析

本研究分離的FAdV ZZ株(GenBank登錄號：MN337322.1)的基因組全長為43 725 bp，GC含量為54.87%?；谌蚪M序列的系統(tǒng)進化分析表明該分離株為禽腺病毒C亞群血清4型，命名為FAdV-4 ZZ株(圖4)。與無毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，FAdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因的缺失，FAdV-4 ZZ株與ON1株和KR5株的核苷酸序列相似性分別為98.45%和98.77%。FAdV-4 ZZ株與國內首次分離的JSJ13株相比，ORF29序列存在33個堿基缺失，表明我國不同地區(qū)流行的FAdV-4毒株在序列上存在差異。

圖4 FAdVs的全基因組分子進化分析Fig.4 The genome-wide phylogenetic analysis of FAdVs

2.5 分離毒株Hexon基因的分子進化分析

FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白含937個氨基酸?；贖exon基因的分子進化分析同樣表明該分離株為禽腺病毒C亞群血清4型(圖5)。FAdV-4 ZZ株的Hexon基因與國內流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均為100%；與ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分別為98.69%和98.90%。FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白與國內流行的CH/JSXZ/2015株和SDSX1株的氨基酸序列完全一致，與ON1株和KR5株的Hexon蛋白氨基酸序列分別存在13個和12個氨基酸突變，可能對其抗原表位和免疫原性產生影響(表1)。

圖5 FAdVs Hexon基因的分子進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of FAdVs Hexon gene

表1 Hexon蛋白氨基酸序列的比對Tab.1 Alignment of amino acids of Hexon protein of FAdV-4 ZZ

3 結論與討論

1987年，雞心包積水綜合征(HPS)在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次被報道，因此它也被稱為“安卡拉”病，隨后該病出現在印度、墨西哥、俄羅斯、韓國、日本等國家[16]。2007—2013年，IBH和HPS病例在我國以散發(fā)為主，但2014年以來，國內雞群HPS病例迅速增加[3]。研究表明，FAdV-4變異株感染是引起此次HPS疫情的主要原因[10-11]。河南省是家禽養(yǎng)殖大省，HPS疫情對全省的家禽養(yǎng)殖造成了嚴重影響。深入研究FAdV-4病毒的基因組特征和分子進化關系對有效防控FAdV-4感染和HPS暴發(fā)具有重要意義。

基于全基因組序列和Hexon基因的分子進化分析均表明，該分離株為FAdV-4。進一步研究發(fā)現，FAdV-4 ZZ株可以使LMH細胞產生明顯的病變，并可在該細胞系上穩(wěn)定傳代。與無毒力的ON1株和KR5株相比，FAdV-4 ZZ株以及國內流行的JSXZ-2015、JSJ13株和SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失。ORF19基因編碼病毒的脂肪酶(Lipase)，研究推測國外流行株FAdV-4 SHP95的高致病性可能與ORF19基因被終止密碼子打斷有關[17]。國內FAdV-4流行株是否因ORF19基因缺失而使毒力增強有待進一步研究。FAdV-4 ZZ株以及CH/JSXZ/2015株和SDSX1株與國內首次分離的JSJ13株相比，ORF29序列均存在33個堿基缺失，表明我國不同地區(qū)流行著含有2種不同ORF29序列的FAdV-4毒株，目前尚不清楚這一基因缺失對FAdV-4毒株復制和致病力的具體影響。Hexon蛋白是FAdV的主要結構蛋白，具有血清型特異性，含有中和性抗原表位[6,18]。FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白與國內流行的JSXZ-2015株和SDSX1株的氨基酸序列完全一致，與ON1株和KR5株的Hexon蛋白氨基酸序列分別存在13個和12個氨基酸突變，這些變異對Hexon蛋白抗原表位和免疫原性的影響有待研究。

2014年以來，HPS疫情在我國多個省份出現，對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。研究發(fā)現，從商品化的新城疫弱毒苗中可以分離出FAdV-4型病毒，這可能是FAdV感染在國內雞群中大面積流行的原因之一[19]。此外，除了FAdV-4型，我國部分地區(qū)也流行著FAdV-8b、FAdV-10、FAdV-11等血清型[20-21]?？梢?，當前防控FAdV感染的形勢較為嚴峻。分析國內FAdV流行株的基因組特征和分子進化關系，對于有效防控FAdV感染和HPS暴發(fā)具有重要價值。本研究對FAdV-4 ZZ株的分離及全基因組序列測定明確了FAdV-4河南流行株和國內外流行株的進化關系，為建立FAdV-4特異性檢測方法和疫苗研究奠定了基礎。