李 志,張瑩瑩,張璐璐,李 曉,范 剛,彭芷芊,任婧楠,潘思軼(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室,湖北武漢 430070)

檸檬烯(limonene)又稱苧烯,是一種單萜類化合物,在自然界中廣泛存在。檸檬烯是柑橘類水果香氣成分中的主要成分,相對含量達到95%左右[1]。檸檬烯作為柑橘業(yè)加工的副產(chǎn)物,每年的產(chǎn)量達到50000噸,且價格非常便宜[2]。檸檬烯化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,光照和加熱都會使其發(fā)生自身氧化反應(yīng)[3],且香氣值較低,使其在香精香料領(lǐng)域的應(yīng)用存在一定局限性,而與檸檬烯具有相同骨架的一些含氧化合物,包括紫蘇醇、松油醇、香芹酮等,具有更加獨特的芳香氣味,是高級香精香料的原料,有更高的經(jīng)濟價值,而且還具有抗菌、抗腫瘤等重要的藥理作用[4]。

香芹系列香料是調(diào)配高級食品和化妝品香精的重要原料,代表化合物為香芹醇、香芹酮、二氫香芹酮、二氫香芹醇等。其中二氫香芹酮存在于長葉留蘭香、蒔蘿、當歸子中,具有清涼薄荷香味,可用于調(diào)配糖果、口香糖、興奮飲料等食用香精,也用于口腔衛(wèi)生用品中[5]。除此之外在殺蟲、抑菌等方面,二氫香芹酮也被證實有顯著功效[6-7]。

目前,香芹系列香料的獲取有物理提取法、化學(xué)合成法及微生物轉(zhuǎn)化法,其中以化學(xué)合成法為主。有文獻報道,在Ni、Pt、Pd、Rh、Ru、Au-TiO2等催化劑的作用下可將香芹酮轉(zhuǎn)化成二氫香芹酮[8],而這種方法常常導(dǎo)致其它不飽和官能團的氫化,從而生成多種復(fù)雜的化合物,且產(chǎn)率較低。相比較而言,利用微生物轉(zhuǎn)化制備香精香料具有高度專一性、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、收率高、成本低及反應(yīng)步驟少等優(yōu)點[9],利用這種方法得到的香精香料可以被認為是“天然的”,而消費者往往更青睞于“天然的”香精香料產(chǎn)品。在此背景下,研究二氫香芹酮的生物合成是很有必要的。有研究表明微生物可以利用檸檬烯,在NADPH依賴的檸檬烯-6-單加氧酶作用下通過6位羥基化生成香芹醇,隨后在香芹醇脫氫酶作用下生成香芹酮,最終在香芹酮還原酶作用下生成二氫香芹酮[10-14]。

在本實驗室之前的工作中,篩選到一株能利用檸檬烯為唯一碳源生長的微生物菌株。經(jīng)鑒定為Klebsiellasp.,屬于細菌域,變形菌門,γ-變形菌綱,腸桿菌目,腸桿菌科,克雷伯桿菌屬。該菌種可將檸檬烯轉(zhuǎn)化為二氫香芹醇、β-松油醇和檸檬烯-1,2-環(huán)氧產(chǎn)物。其中反式二氫香芹酮是Klebsiellasp. O852轉(zhuǎn)化檸檬烯的主要產(chǎn)物,目前尚沒有文章報道Klebsiellasp.可以進行檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Klebsiellasp. 實驗室保存菌種;LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母浸粉5,氯化鈉10,pH自然,在121 ℃下滅菌20 min;(+)-檸檬烯(>95.0%) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;無水乙醇、環(huán)己酮、氯化鈉、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、鹽酸 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;BCA蛋白定量測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;KYC-1102恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;AR522CN型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;pH計(PB-10) Sartorius公司;Agilent 6890N GC-5975B質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;Centrifuge 5415R高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司;VCX750高強度超聲波細胞破碎儀 Sonics公司;Avanti J-E高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備 無菌條件下,用接種環(huán)挑取一環(huán)Klebsiellasp.的單菌落在LB培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接2次,將50 μL菌液接種至100 mL培養(yǎng)基中,于37 ℃,210 r/min條件下培養(yǎng)12 h,作為種子液備用。

1.2.2 菌體制備 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)8 h。培養(yǎng)結(jié)束后在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,棄上清,用pH=7.0,10 mmol/L的PBS緩沖液洗滌菌體,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,棄上清,重復(fù)兩次,得到菌體。

1.2.3 粗酶液制備 所得到的菌體,用10 mmol/L pH=7.0的PBS緩沖液,按照一定的料液比對菌體進行重懸,使用超聲波細胞破碎儀,在一定的振幅條件下超聲處理一定的時間進行細胞破碎。超聲工作時間3 s,間歇時間5 s,每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液[15]。

1.2.4 酶的定位 按照1.2.2的方法進行培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后取菌液1 mL,剩余菌液在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min,分別收集發(fā)酵液和菌體,取發(fā)酵液1 mL,菌體按照1.2.3的方法進行破碎獲取粗酶液,取粗酶液1 mL。分別向菌液、發(fā)酵液、粗酶液中各加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h,用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測反式二氫香芹酮含量[16]。

1.2.5 克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.2.5.1 克雷伯桿菌O852生長曲線的繪制 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)48 h,期間每4 h取一次樣,測定其在600 nm處的吸光度值。以無菌的液體培養(yǎng)基作為空白對照。以時間為橫坐標,以O(shè)D600值為縱坐標,繪制菌種的生長曲線,以確定菌種的對數(shù)生長期[17]。

1.2.5.2 培養(yǎng)時間對酶活的影響 將種子液按1%的接種量接種在培養(yǎng)基中,于37 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)24 h,在培養(yǎng)至4、8、12、16、20、24 h時分別取樣,按照1.2.3的方法制備粗酶液,取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h。比較不同培養(yǎng)時間條件下的酶活性,以此考察在不同的生長時期,實驗菌種產(chǎn)酶能力的差別[18]。

1.2.5.3 緩沖體系對酶活的影響 按照1.2.2的方法進行培養(yǎng),將洗滌和重懸菌體所用的緩沖液分別換做10 mmol/L pH=7.0的PBS、Tris-HCl、HEPES緩沖液,并以此緩沖液作為酶促反應(yīng)的介質(zhì)。取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化12 h?？疾觳煌彌_體系對酶活的影響[19]。

1.2.5.4 轉(zhuǎn)化時間對酶活的影響 按照1.2.3的方法制備粗酶液,取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下,分別轉(zhuǎn)化4、8、12、16、20、24 h,考察不同轉(zhuǎn)化時間對酶活的影響[20]。

1.2.6 蛋白含量的測定 使用BCA(bicinchonininc acid)蛋白濃度試劑盒進行樣品中蛋白濃度的測定。將試劑A和試劑B按50∶1的比例配制成BCA工作液。蛋白標準品依此取0、2、4、6、8、10 μL,粗酶液取2 μL加入96孔板,加10 mmol/L的PBS緩沖液補足到10 μL。每個測定做3個平行。向粗酶液和蛋白標準品中加入200 μL BCA工作液,混勻。37 ℃反應(yīng)30 min后,使用酶標儀在562 nm波長下測定吸光度值,制作標準曲線,其線性回歸方程為y=0.572x+0.1308,線性決定系數(shù)R2=0.995 4,從標準曲線中求出樣品濃度。

1.2.7 檸檬烯轉(zhuǎn)化生成反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活測定方法及得率的計算 取粗酶液1 mL,加入1 μL檸檬烯作為底物,在37 ℃,210 r/min條件下轉(zhuǎn)化4 h,即為轉(zhuǎn)化液。反式二氫香芹酮的含量采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行測定。取1 mL轉(zhuǎn)化液入30 mL萃取瓶中,40 ℃條件下平衡15 min,插入已活化好的50/30 pm DVB/CAR/PDMS的SPME萃取頭(270 ℃活化l h),推出纖維頭,頂空吸附40 min后,插入GC-MS進樣口解析5 min。

氣相色譜條件:毛細管柱為HP-5(30 m×320 μm×0.25 μm),程序升溫,起始溫度40 ℃,保持3 min,以3 ℃/min升至160 ℃,保持2 min,再以8 ℃/min升至220 ℃,保持3 min。進樣口溫度250 ℃,檢測器溫度:FID 250 ℃。

質(zhì)譜條件:離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,離子化方式EI,電子能量70 eV,質(zhì)量范圍為45～550 AMU/sec。

采用內(nèi)標法進行定量,將環(huán)己酮按1∶1000的比例稀釋于無水乙醇中,吸取10 μL與樣品混合作為內(nèi)標。1 mL粗酶液1 h內(nèi)產(chǎn)生1 μg反式二氫香芹酮定義為1 U。酶活含量為處理單位質(zhì)量的菌體所得到的酶活含量,單位為U/g[21]。

產(chǎn)反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活含量(U/g)=樣品中產(chǎn)反式二氫香芹酮關(guān)鍵酶酶活(U)/菌體質(zhì)量(g)

采用內(nèi)標法測定反式二氫香芹酮的含量的計算公式如下:

反式二氫香芹酮的含量(mg/L)=(反式二氫香芹酮峰面積×內(nèi)標物質(zhì)量(mg))/(內(nèi)標物峰面積×樣品體積(L))

1.2.8 超聲波破碎條件單因素實驗

1.2.8.1 超聲時間的選擇 將菌體按照1∶5的料液比重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細胞破碎儀,在振幅30%,超聲工作時間3 s,間歇時間5 s的條件下進行細胞破碎,總時間分別設(shè)置為5、10、15、20、25、30 min,每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察超聲總時間對酶活得率的影響。

1.2.8.2 料液比的選擇 將菌體重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細胞破碎儀,在振幅30%,超聲工作時間3 s,間歇時間5 s,總時間20 min的條件下進行細胞破碎,料液比分別設(shè)置為1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20。每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察料液比對酶活得率的影響。

1.2.8.3 振幅的選擇 將菌體按照1∶5的料液比重懸于10 mmol/L的PBS緩沖液中,使用超聲波細胞破碎儀,在超聲工作時間3 s,間歇時間5 s,總時間20 min的條件下進行細胞破碎,振幅分別設(shè)置為20%、25%、30%、35%、40%。每次超聲破碎的體積為5 mL。破碎完成后,在10000 r/min,4 ℃條件下離心30 min。收集上清即為粗酶液,考察振幅對酶活得率的影響。

1.2.9 超聲波破碎條件的響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素實驗基礎(chǔ)上,以超聲時間(A)、料液比(B)、振幅(C)為自變量,單位質(zhì)量菌體中獲得的酶活總量(Y)為響應(yīng)值,利用Design-Expert. V8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計實驗,采用響應(yīng)面分析方法對Klebsiellasp.轉(zhuǎn)化檸檬烯生成反式二氫香芹酮的關(guān)鍵酶的最佳提取工藝參數(shù)進行了優(yōu)化設(shè)計,響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面考察因素及水平Table 1 Factors and levels coding of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)三次并取其平均值進行分析,采用Design-Expert. V8.0.6軟件進行響應(yīng)面組合實驗,采用origin 2017進行數(shù)據(jù)分析并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的定位

培養(yǎng)后的菌液、發(fā)酵液和粗酶液轉(zhuǎn)化相同時間得到的產(chǎn)物含量如圖1所示,在培養(yǎng)后的菌液中可以檢測到產(chǎn)物生成,可見此菌種可利用環(huán)境中的檸檬烯進行生物轉(zhuǎn)化,生成反式二氫香芹酮。將菌液做離心處理后,在發(fā)酵液中幾乎無產(chǎn)物生成,而在菌體破碎后獲取的粗酶液中可以檢測到一定量的反式二氫香芹酮,由此可初步判斷該酶為胞內(nèi)酶。

圖1 菌液、發(fā)酵液和菌體轉(zhuǎn)化生成反式二氫香芹酮的含量Fig.1 Contents of trans-dihydrocarvone produced by bacterial solution,fermentation broth and bacterial cells

2.2 克雷伯桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.2.1 克雷伯桿菌O852生長曲線的繪制 細菌的生長通常分為延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰亡期四個階段[22-23]。如圖2所示,在本實驗條件下,菌體迅速進入對數(shù)生長期,而未出現(xiàn)明顯的延滯期,這與侯星[24]研究的產(chǎn)α-半乳糖苷酶的成團泛菌在37 ℃條件下的生長曲線結(jié)果相類似。在12 h左右達到穩(wěn)定期。

圖2 Klebsiella sp. O852的生長曲線Fig.2 Growth curve of Klebsiella sp. O852

2.2.2 培養(yǎng)時間對酶活的影響 菌體產(chǎn)酶能力隨時間的變化如圖3所示,在0～8 h范圍內(nèi),酶活隨培養(yǎng)時間的延長而增大,在8 h時有最大酶活,為(6.60±0.30) U,對應(yīng)菌種生長的對數(shù)中期,表明此時酶活力最為旺盛,隨后酶活呈下降趨勢并在12～24 h范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。當菌種生長進入穩(wěn)定期后,酶活基本保持不變。在后續(xù)的實驗中選擇8 h作為菌體的培養(yǎng)時間。

圖3 培養(yǎng)時間對酶活的影響Fig.3 Effect of culture time on enzyme activity

2.2.3 緩沖體系對酶活的影響 用一系列不同的緩沖體系對菌體進行洗滌,重懸,并作為酶促反應(yīng)的介質(zhì),探討不同緩沖體系對酶活的影響,結(jié)果如圖4所示。以磷酸鹽緩沖液(PBS)為緩沖體系時,得到的酶活最高,為(5.48±0.18) U。這可能是因為這種緩沖體系能提供更適宜的緩沖介質(zhì)環(huán)境,從而一定程度上提高了酶活[19]。在后續(xù)的實驗中,選擇PBS提取該酶。

圖4 緩沖體系對酶活的影響Fig.4 Effect of buffer on enzyme activity

2.2.4 轉(zhuǎn)化時間對酶活的影響 如圖5所示,轉(zhuǎn)化開始時,隨著轉(zhuǎn)化時間的增加,酶活成持續(xù)下降趨勢,在4 h時的酶活最高,為(16.92±1.83) U,約是8 h時的2倍左右。轉(zhuǎn)化時間為12、16、20和24 h時,酶活變化較為穩(wěn)定。這可能是因為酶的反應(yīng)速度較快,在4 h時已轉(zhuǎn)化完全,此后即便延長轉(zhuǎn)化時間,也不會有產(chǎn)物的生成。且隨著轉(zhuǎn)化時間的延長,產(chǎn)物可能存在分解等狀況。故在后續(xù)的研究中選取4 h為轉(zhuǎn)化時間。

圖5 轉(zhuǎn)化時間對酶活的影響Fig.5 Effect of conversion time on enzyme activity

2.3 單因素實驗

2.3.1 超聲時間對相關(guān)酶酶活及蛋白含量的影響 如圖6所示,總蛋白濃度隨著超聲時間的延長而增加,而酶活則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,但變化趨勢不明顯。超聲時間的延長有助于細胞破壁和蛋白的釋放,而時間過長,體系內(nèi)熱量增加可能導(dǎo)致酶的催化活性部分受損,從而降低酶活[25]。綜上選取最佳超聲時間為20 min。

圖6 超聲時間對酶活及蛋白含量的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on enzyme activity and protein content注:同一指標的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖7～圖8同。

2.3.2 料液比對相關(guān)酶活及蛋白含量的影響 如圖7所示,總蛋白濃度隨著料液比的增大而減少,而酶活則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在1∶10時達到最高。料液比較低時,相同體積的樣品中所含菌體量較大,因此,破碎菌體能夠釋放更多的蛋白。當料液比較小時,不利于空化作用和均勻化作用的發(fā)揮,且容易導(dǎo)致局部過熱致酶失活[26]。隨著料液比增大,細胞破碎更為完全,使酶活得到升高,料液比繼續(xù)增大,菌體過少導(dǎo)致得不到足夠的酶量,使酶活降低。綜上選取最佳料液比為1∶10。

圖7 料液比對酶活及蛋白含量的影響Fig.7 Effect of material-liquid ratio of enzyme activity and protein content

2.3.3 振幅對相關(guān)酶活及蛋白含量的影響 如圖8所示,總蛋白濃度隨著振幅的增高而增加,當振幅達到35%時,蛋白濃度基本不變,說明可提取的蛋白已基本完全提取,酶活隨著振幅的增高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在35%時達到最高。隨著振幅的增高,超聲提取對細胞的破壞作用增大,有助于細胞破壁和蛋白的釋放,而振幅過高,可能使得體系中局部溫度、壓力過高,進而導(dǎo)致酶的失活[27]。綜上選取最佳振幅為35%。

圖8 振幅對酶活及蛋白含量的影響Fig.8 Effect of amplitudeon enzyme activity and protein content

2.4 響應(yīng)面實驗

2.4.1 模型的建立與顯著性分析 響應(yīng)面法可在實驗次數(shù)較少的情況下,全面考察各種因素及其交互作用對實驗結(jié)果的影響,從而有效的確定最佳條件[28]。根據(jù)此前的單因素實驗結(jié)果,以超聲時間、料液比、振幅為自變量,以酶活為響應(yīng)值進行試驗設(shè)計。響應(yīng)面試驗各組結(jié)果見表2,利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進行回歸擬合,建立數(shù)學(xué)模型如下:

Y=38.24+0.71A+2.71B+1.58C+2.56AB-2.18AC+1.47BC-4.19A2-3.09B2-4.97C2。對模型進行方差分析,結(jié)果見表3。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示,擬合模型具有顯著性(P=0.0047<0.01),失擬項不顯著(P=0.7718),回歸方程決定系數(shù)R2=0.9181,表示91.81%的酶活變化可由此模型解釋,以上內(nèi)容說明該模型與實際情況擬合良好。一次項中料液比顯著,超聲時間和振幅不顯著;二次項均顯著;交互項均不顯著。說明各因素和響應(yīng)值之間非簡單的線性關(guān)系。根據(jù)F值可以得出影響酶活的大小順序為料液比>振幅>超聲時間。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis of the regression model

2.4.2 模型交互項的解析 三因素之間的三維響應(yīng)曲面圖及等高線圖如圖9所示。等高線圖中形狀呈橢圓形且排列密集,說明兩因素之間存在明顯的交互作用,呈圓形且排列稀疏則說明交互作用不明顯[29];在三維響應(yīng)曲面圖中,當曲面的坡度較為平緩,說明兩因素交互作用對實驗結(jié)果影響較大,若坡度較為陡峭則相反[30]。從圖9中可以看出,隨著各因素的水平在一定范圍內(nèi)增大,酶活均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,各因素對酶活影響的響應(yīng)曲面坡度較為平緩,等高線呈橢圓形但排列較為稀疏,這說明兩因素間的交互作用均不顯著[31],這與方差分析的結(jié)果相同。根據(jù)二次多元回歸方程的擬合,得到的最佳超聲提取工藝預(yù)測值為:超聲時間21.03 min,料液比1∶12.86,振幅為35.99%,在此條件下,最佳酶活為39.25 U/g。

2.4.3 最佳工藝條件驗證 根據(jù)最佳工藝預(yù)測值,將提取工藝定為超聲時間21 min,料液比1∶13,振幅36%,進行三次驗證,得到平均酶活為(40.97±2.02) U/g,與理論值基本相符,說明回歸模型能夠較好的預(yù)測酶活,優(yōu)化結(jié)果可靠。

圖9 因素間交互作用的影響Fig.9 The effect of interaction of factors

3 結(jié)論

通過分別使用發(fā)酵液和粗酶液進行生物轉(zhuǎn)化,可以判斷該酶為胞內(nèi)酶。培養(yǎng)時間達到8 h時進行細胞破碎,獲取的粗酶液用以進行生物轉(zhuǎn)化,得到的酶活最高。參照生長曲線可知,此時對應(yīng)細胞生長的對數(shù)中期。研究發(fā)現(xiàn)酶活隨轉(zhuǎn)化時間的延長而逐漸降低,在4 h時測得的酶活最高。提取時選用磷酸鹽緩沖液獲得的酶活最高,說明磷酸鹽緩沖液可較好的保護酶活。通過單因素實驗,并使用響應(yīng)面法對超聲提取該酶的工藝進行了優(yōu)化,得出當提取工藝為超聲時間21 min,料液比1∶13,振幅36%時,獲得酶活最高,達到(40.97±2.02)U/g。