祝珊珊， 秦 飛， 陳仲巍， 畢麗偉， 陳 丹， 許 莉， 鄭曉輝

(廈門醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)系藥物檢測中心、 2. 廈門市海洋藥用天然產(chǎn)物資源重點實驗室、 3.機能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361026)

肝細胞癌作為威脅全球公共衛(wèi)生安全的第三位致死性癌癥[1-3]，由于其預(yù)后較低，在早期很難被發(fā)現(xiàn)，依靠手術(shù)治療也常導(dǎo)致其易發(fā)生轉(zhuǎn)移，目前還未有特效藥物的治療。索拉菲尼(Sorafenib, So)是一種新型多靶向能抑制多種癌基因激酶活性的藥物，在治療肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌以及乳腺癌中也見報道，也是唯一被批準(zhǔn)作為治療晚期肝癌的系統(tǒng)性藥物[4-5]。盡管索拉菲尼提高了肝癌患者的總體生存率，但在肝癌患者中發(fā)現(xiàn)了對索拉菲尼的獲得性耐藥，這導(dǎo)致了不良的治療預(yù)后效果[6-10]。而且，索拉菲尼通過干擾受體酪氨酸激酶(VEGFR，PDGFR)抑制腫瘤血管生成，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的腫瘤內(nèi)缺氧和耐藥性。藥代動力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)藥物轉(zhuǎn)運蛋白家族成員ATP-結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白可將索拉菲尼在體內(nèi)的原型物質(zhì)排放至膽小管，與膽汁一起排出體外[11]，證實了索拉菲尼在體內(nèi)的耐藥與患者對索拉菲尼的藥物外排作用相關(guān)，導(dǎo)致腫瘤對索拉菲尼的耐藥性限制了其治療作用。本研究主要通過對肝細胞癌HepG2的研究，找出索拉菲尼在誘導(dǎo)肝癌細胞增殖和凋亡中的作用，以及在耐藥基因表達調(diào)控方面的作用機理，為索拉菲尼在體內(nèi)的耐藥找出相關(guān)聯(lián)的靶點基因，為后續(xù)化療藥的耐藥治療提供科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑索拉菲尼來自福州腫瘤醫(yī)院，凋亡試劑(Annexin V-FITC/PI)購自Biolegend公司，英國Abcam抗體如下：PTEN抗體(Ab32199)，ABCG2抗體(Ab207732)，GAPDH(Ab181602)，Bcl-2(Ab16495)，Bax(Ab32503)；ABCC2購自CST(#4446)；p-AKT抗體為Proteintech(No 66444-1g)。DMEM培養(yǎng)基，PBS磷酸鹽緩沖液購買自Hyclone；胎牛血清和胰酶均購自Gibco；CCK-8試劑盒為上海東仁化學(xué)科技有限公司，結(jié)晶紫染料購自索來寶(Solarbio)公司。

1.2 主要儀器CO2培養(yǎng)箱(新加坡ESCO,CCL-170B)，熒光顯微鏡系統(tǒng)(Lecia，DMI8)，流式細胞分析儀(Beckman ，F(xiàn)C500),多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan，M1000PRO)，電泳及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)。

2 方法

2.1 藥物配制利用二甲基亞砜(DMSO)將索拉菲尼配置成100 mmol·L-1的母液，并分裝保存于-20 ℃冰箱。使用時，用培養(yǎng)基將母液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 肝癌細胞株HepG2細胞復(fù)蘇自本實驗室液氮罐。DMEM培養(yǎng)基(10% FBS，100 U·L-1青鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.3 CCK-8法測定細胞活性待細胞長滿后，用胰酶消化，計數(shù)后將細胞重懸后，細胞5×103·L-1/孔，每組3個復(fù)孔，加入配制的不同濃度索拉菲尼溶液(0、1、2.5、5、10、15 μmol·L-1；繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24和48 h，以加0 μmol·L-1組為對照組，不加細胞只加培養(yǎng)基組為調(diào)零孔，每孔細胞加入10 μL CCK-8溶液，酶標(biāo)儀測定細胞吸光值。細胞的相對增殖率/%=(試驗孔-調(diào)零孔)/(對照孔-調(diào)零孔)×100%，計算細胞相對增殖率，實驗重復(fù)3次。

2.4 結(jié)晶紫染色將細胞以1×105·L-1接種于6孔板中，每孔2 mL，均勻分布。24 h后加入不同濃度的索拉菲尼(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)，作用24 h后將舊培養(yǎng)基吸出，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入500 μL配制好的結(jié)晶紫染色液，繼續(xù)放置37 ℃放置20 min后，熒光倒置顯微鏡下拍照記錄。

2.5 流式凋亡檢測HepG2傳至6孔板，按照(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)濃度加入索拉菲尼處理24 h，取出細胞，胰酶消化后，收集每孔內(nèi)所有細胞(含上清內(nèi)的細胞)，加入凋亡染液PI 5 μL/管，F(xiàn)ITC 10 μL/管，4 ℃避光孵育20 min，上機分析細胞凋亡數(shù)據(jù)。

2.6 Western blot 法檢測細胞內(nèi)蛋白表達待細胞長到對數(shù)期后，傳代至6 cm盤內(nèi)，24 h后加不同濃度(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)索拉菲尼處理，24 h后，收細胞，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。蛋白Loading buffer 煮沸后-20 ℃冰箱保存。配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣30 μg提取的細胞總蛋白，進行蛋白含量的實驗分析。抗體濃度，PTEN(1 ∶2 000)；p-AKT(1 ∶1 000)；ABCC2(1 ∶5 000)；ABCG2(1 ∶5 000)；Bax(1 ∶2 000)；Bcl-2(1 ∶5 000)；GAPDH(1 ∶5 000)。

3 結(jié)果

3.1 索拉菲尼可降低細胞活性如Fig 1A，索拉菲尼能抑制HepG2細胞活性，且濃度在5 μmol·L-1后，藥物的抑制作用呈濃度和時間依賴性。結(jié)晶紫染色實驗也證實，如Fig B和C所示，隨著藥物作用濃度的增加，HepG2細胞的死亡增多，活性細胞數(shù)下降(P<0.05)。

Fig 1 The toxic effects of sorafenib on viability of HepG2 A: CCK-8 detected the cell survival of HepG2 cells by sorafenib; B: Crystal vilote staining analyzed the cell viability of HepG2 cells; C: Crystal violet rates

3.2 索拉菲尼對細胞凋亡的影響索拉菲尼作用于24 h后，流式凋亡雙染結(jié)果如Fig 2所示，各組細胞的凋亡百分含量見Tab 1。與對照組相比，在1、2.5、5、10 μmol·L-1索拉菲尼作用下，HepG2細胞的早期凋亡和晚期凋亡率均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性。

Tab 1 Apoptosis in HepG2 cells treated with different concentrations of

Fig 2 Apoptosis treated with sorafenib in HepG2 cells analyzed by flow cytometry

3.3 索拉菲尼對肝癌細胞內(nèi)蛋白表達的影響為探討索拉菲尼對HepG2的凋亡相關(guān)信號通路機制，如Fig 3A所示，HepG2細胞內(nèi)PTEN、Bax蛋白隨著藥物濃度的增加而上調(diào)；p-AKT、Bcl-2、ABCC2和ABCG2表達下降。PTEN是一個在多數(shù)腫瘤中表達缺失的抑癌基因，在索拉菲尼加藥誘導(dǎo)后，表達增加，說明索拉菲尼激活了細胞內(nèi)PTEN的表達。但是否直接激活，還需要進一步研究確定關(guān)系。

Fig 3 Protein expression of ABCC2，ABCG2，PTEN，A: Protein bands of ABCC2，ABCG2，PTEN，p-AKT，Bcl-2，Bax and GAPDH in HepG2; B: Relative protein expression levels of ABCC2，ABCG2，PTEN，p-AKT，Bcl-2，Bax *P<0.05 vs sorafenib 0 μmol·L-1 group. So 0：0 μmol·L-1；So1：1 μmol·L-1；So2.5:2.5 μmol·L-1；So5：5 μmol·L-1；So10：10 μmol·L-1

4 結(jié)論

作為一種多靶點的激酶抑制劑，索拉菲尼可抑制多種腫瘤細胞的生長，目前主要用于治療不能手術(shù)或者遠處轉(zhuǎn)移性肝癌晚期患者[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，在服用索拉菲尼治療的晚期肝癌患者體內(nèi)，pERK和VEGFR-2發(fā)生高表達，預(yù)示索拉菲尼治療晚期肝癌的不良預(yù)后[7]。而這種不良預(yù)后與機體對索拉菲尼產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼能誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，Western blot實驗也證實與凋亡相關(guān)基因Bax的表達隨索拉菲尼濃度增加而上升，相反，與抑制凋亡有關(guān)的基因Bcl-2蛋白表達下降，證實索拉菲尼可誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。PTEN通常在腫瘤細胞內(nèi)表達缺失，往往導(dǎo)致PI3K/AKT信號的非正常表達。實驗結(jié)果顯示，索拉菲尼激活了HepG2細胞中PTEN的蛋白表達，提示索拉菲尼可通過激活PTEN的作用降低下游激酶的活性，實驗結(jié)果證實PTEN下游磷酸激酶p-AKT的蛋白表達隨著索拉菲尼的作用發(fā)生下降。說明索拉菲尼可能通過PTEN的激活降低p-AKT的活性。既往研究表明p-AKT/PI3K信號通路與ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族相關(guān)成員ABCC2和ABCG2的表達有關(guān)，這類蛋白的表達與藥物從細胞內(nèi)泵出，降低藥物療效而使腫瘤細胞獲得耐藥的功能相關(guān)[13-15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因ABCC2和ABCG2在索拉菲尼作用下表達下降，提示索拉菲尼可能通過降低ABCC2和ABCG2的過表達誘導(dǎo)的肝癌細胞增殖，從而增強肝癌細胞的凋亡。

由此，可以得出索拉菲尼誘導(dǎo)體外肝癌細胞的凋亡進程中，可能通過激活PTEN的表達降低磷酸激酶AKT信號擴增，從而降低耐藥基因ABCC2和ABCG2的表達，增加凋亡蛋白Bax的表達，降低抑制凋亡作用蛋白Bcl-2的表達，進而增加索拉菲尼藥物在肝癌細胞內(nèi)的利用率極大限度地誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2的凋亡。而PTEN基因在腫瘤細胞內(nèi)是否直接參與調(diào)控耐藥基因的表達，這種調(diào)控作用與腫瘤細胞系以及索拉菲尼的藥物濃度是否有關(guān)聯(lián)，還需要進一步的實驗研究。