張 利，周夢園，鄭丹琳，秦曉玥，李穗敏，曾 鵬，鄺素娟，楊 慧，饒 芳，鄧春玉,3,4

[1. 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2. 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)醫(yī)學(xué)研究部臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080；3. 華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；4. 廣東省心血管病研究所心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510100]

糖尿病患者首次確診時(shí)，多已伴有心血管并發(fā)癥，臨床上冠狀動脈粥樣硬化是其主要的致死原因[1]。糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙是其重要的病理生理特征，近年來大量研究表明，糖尿病的發(fā)生也伴隨著血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)功能異常，并影響著許多重要動脈的收縮。已有文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病大鼠主動脈和冠狀動脈的血管反應(yīng)性發(fā)生變化，糖尿病主動脈的收縮反應(yīng)減弱，冠狀動脈的舒張功能減弱，而收縮變化不明顯[2-3]；然而，糖尿病小鼠胸主動脈血管收縮反應(yīng)卻明顯增強(qiáng)[4]，提示不同種屬和器官的糖尿病血管反應(yīng)性變化存在差異，但糖尿病對小鼠冠狀動脈收縮影響的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道甚少，有待進(jìn)一步闡明。

胞內(nèi)游離Ca2+在介導(dǎo)VSMCs收縮功能中起著重要作用[5]。VSMCs內(nèi)Ca2+濃度變化受肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放和胞外鈣內(nèi)流的影響，其中L-型鈣通道和鈣庫操縱性鈣(store-operated calcium，SOC)通道是外鈣內(nèi)流的主要途徑[6-7]。已有研究表明，糖尿病使L-型鈣通道和SOC通道功能發(fā)生改變[2-4]，提示細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控異常與糖尿病血管反應(yīng)性變化密切相關(guān)。因此，本研究通過給予不同的血管收縮劑5-羥色胺(5-hydroxyl tryptamine，5-HT)和血栓素A2類似物(9,11-dideoxy-11α, 9α-epoxymethanoprostaglandin，U46619)及不同信號通路阻斷劑硝苯地平(nifedipine)和毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)，觀察糖尿病冠狀動脈血管張力變化，探討糖尿病對鈣調(diào)控參與冠狀動脈收縮反應(yīng)性的差異，以研究糖尿病對小鼠冠狀動脈收縮的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物U46619、5-HT(091M5163V)、硝苯地平(57H1139)、鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ；031M1287V)、毒胡蘿卜素(049M4032V)、咖啡因(Caffeine；71K1877)、EGTA(111K5411)均購于Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Krebs Henseleit(K-H)溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1；高鉀K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KH2PO41.2、CaCl22.5、D-glucose 11.1。Ca2+-free K-H溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05。實(shí)驗(yàn)所用溶液配好后均通混合氣(95% O2+5% CO2)充分飽和。

1.2 儀器620 M型小血管張力測定儀(丹麥DMT公司)；PowerLab 8/30生物信號采集處理系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)；Stemi DV4 型體視顯微鏡(德國ZEISS公司)；DK-8D 型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；Advatage血糖儀和血糖試紙(Roche)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物SPF級，8～9周齡C57BL/6小鼠，♂，共30只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2018-0008，飼養(yǎng)于華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。本研究所有動物實(shí)驗(yàn)已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)的動物實(shí)驗(yàn)倫理審查(NoGDRE201208a)。

2 方法

2.1 糖尿病小鼠模型的建立將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組(model)和對照組(control)，每組各15只。模型組和對照組通過腹腔注射分別注入等量STZ(50 mg·kg-1體質(zhì)量)和溶劑(0.1mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.2～4.5)，連續(xù)5 d給藥，同時(shí)給藥前禁食12 h不禁水，給藥后，再禁食2 h[4,8]。一周后使用羅氏血糖檢測試紙和血糖儀，通過尾靜脈采血法定期采集兩組小鼠的血糖水平變化，之后每隔1個(gè)月測量1次血糖水平，測量2次，以最后1次測量的血糖水平為準(zhǔn)，模型組小鼠血糖高于16 mmol·L-1視為造模成功。

2.2 冠狀動脈環(huán)的制備血管環(huán)的制備同已發(fā)表文獻(xiàn)[9-10]，簡而言之，通過CO2麻醉并處死小鼠后，快速取出心臟，放入4 ℃預(yù)冷的K-H(Krebs Henseleit)溶液中并借助體視顯微鏡去除冠狀動脈周圍的心肌組織，分離出冠狀動脈并剪成長度為1.8～2.0 mm血管環(huán)；用兩根直徑為40 μm的不銹鋼絲穿過血管環(huán)，并將其固定在張力測定儀浴槽內(nèi)的兩個(gè)鉗夾上，同時(shí)鋼絲要保持平行。在37 ℃溫浴的K-H液中平衡30 min后，給予冠狀動脈1.2 mN的基礎(chǔ)張力，平衡60 min，期間每隔15 min換液1次，并使張力維持在1.2 mN。

2.3 藥物對冠狀動脈張力作用的檢測血管張力反應(yīng)性的檢測同已發(fā)表文獻(xiàn)[9, 11]。對血管功能性檢測合格的血管，在浴液中加入單劑量5-HT(2 μmol·L-1)，待血管收縮效應(yīng)達(dá)到最大值后，用Ca2+-freeK-H液洗脫4次，給予1μmol·L-1硝苯地平和2 μmol·L-1TG孵育30 min，加入2.5 mmol·L-1CaCl2，觀察冠脈的血管反應(yīng)性變化；用Ca2+-freeK-H液洗脫并給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育，加入20 mmol·L-1Caffeine，觀察血管張力變化。

采用濃度梯度給藥的方法，在浴液中分別加入各濃度梯度的血管收縮劑5-HT (0.001～10 μmol·L-1)和U46619 (0.000 1～1 μmol·L-1)，觀察血管收縮劑誘導(dǎo)血管張力的變化。當(dāng)血管收縮效應(yīng)達(dá)到最大值后，用K-H液洗脫4次，并加入1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，重復(fù)上述5-HT和U46619濃度梯度給藥，觀察硝苯地平對血管收縮量效曲線的影響。當(dāng)血管收縮效應(yīng)達(dá)到最大值后，用Ca2+-free K-H液洗脫4次，并給予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，再次重復(fù)以上5-HT和U46619濃度梯度給藥，觀察在無鈣條件下硝苯地平對血管收縮張力變化的影響。

3 結(jié)果

3.1 糖尿病小鼠模型建立對照組與模型組小鼠分別注射等量溶劑和STZ，1周后，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的“多飲、多食、多尿和體質(zhì)量減輕”癥狀，對照組與模型組小鼠的體質(zhì)量分別為(18.70±3.06)g和(29.68±2.59)g(n=12，P<0.01)；與對照組(5.1±1.70)mmol·L-1相比，模型組小鼠的血糖水平(25.84±4.48)mmol·L-1明顯升高(n=12，P<0.01)。

3.2 小鼠冠狀動脈收縮的鈣調(diào)控機(jī)制高鉀刺激模型組冠狀動脈(2.84±0.40)mN(n=10)產(chǎn)生的收縮明顯低于對照組(1.86±0.53)mN(n=12)(P<0.01)。在Ca2+-free K-H液中給予L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平和鈣泵阻斷劑TG孵育后，加入2.5 mmol·L-1CaCl2，未引起冠脈收縮；給予20 mmol·L-1Caffeine引起血管急劇收縮。提示冠脈的平滑肌收縮主要由經(jīng)L-型鈣通道內(nèi)流和肌漿網(wǎng)鈣釋放的鈣離子介導(dǎo)，SOC通道不參與冠脈收縮，見Fig 1。

3.3 糖尿病小鼠冠狀動脈對血管收縮劑5-HT和U46619的反應(yīng)采用濃度梯度給藥法分別加入血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和U46619(0.000 1～1 μmol·L-1)，發(fā)現(xiàn)5-HT與U46619均可誘導(dǎo)小鼠冠狀動脈呈明顯的濃度依賴性收縮，模型組小鼠冠狀動脈平滑肌收縮反應(yīng)明顯低于對照組。5-HT誘導(dǎo)模型組冠狀動脈量效曲線的Emax以及pEC50(Emax：64.12±18.23，n=9；pEC50：6.42±0.25，n=9)均明顯低于對照組(Emax：112.75±9.33，n=10；pEC50：7.12±0.20，n=10)(P<0.01)。U46619誘導(dǎo)模型組冠狀動脈量效曲線的pEC50(7.17±0.34，n=9)明顯低于對照組(7.78±0.33，n=8)(P<0.01)，而Emax在兩組間差異無顯著性(P>0.05),見Fig 2。

Fig 1 The mechanism of calcium handling involved in constriction of coronary artery in mice A： High potassium-evoked contraction was stronger in the coronary arterial rings of wild-type mice than of diabetic mice (n control=12, nmodel=10)； B： Coronary arteries were washed in Ca2+-free buffer in the presence of nifedipine (1 μmol·L-1) and TG (2 μmol·L-1) for 30 min, and there was no response to CaCl2 at 2.5 mmol·L-1 in coronary arteries of mice, and caffeine at 20 mmol·L-1 significantly evoked constriction of coronary arteries in mice(n=3). **P<0.01 vs control.

Fig 2 The concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT and U46619 in coronary arterial rings of diabetic mice Representative recording of 5-HT(A)- and U46619 (C)-elicited concentration-dependent contraction in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. The concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT (B) and U46619 (D) in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. 5-HT: ncontrol=10, nmodel=8; U46619: ncontrol=10, nmodel=9. **P<0.01 vs control.

3.4 硝苯地平對血管收縮劑誘導(dǎo)糖尿病小鼠冠狀動脈收縮反應(yīng)的影響加入硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育后，采用濃度梯度給藥法分別給予血管收縮劑5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和U46619(0.000 1～1 μmol·L-1)，記錄冠狀動脈張力變化。結(jié)果顯示，硝苯地平可明顯抑制血管收縮劑誘導(dǎo)冠狀動脈的收縮反應(yīng)；模型組冠狀動脈收縮反應(yīng)明顯低于對照組，硝苯地平對模型組冠狀動脈收縮反應(yīng)的抑制幅度明顯降低(P<0.01)。5-HT誘導(dǎo)模型組冠狀動脈的量效曲線的Emax(6.41±6.73，n=9)明顯低于對照組(15.75±4.15，n=10)(P<0.05)，而兩組間的pEC50差異無顯著性(P>0.05)。在U46619誘導(dǎo)冠狀動脈收縮反應(yīng)，兩組的Emax和pEC50差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見Fig 3。

3.5 肌漿網(wǎng)Ca2+釋放在糖尿病小鼠冠狀動脈收縮反應(yīng)中的變化在Ca2+-free K-H溶液中加入硝苯地平(1 μmol·L-1)孵育后，采用濃度梯度給藥法分別給予5-HT(0.001～10 μmol·L-1)和U46619(0.000 1～1 μmol·L-1)，記錄冠狀動脈張力變化。結(jié)果顯示，在細(xì)胞外液無Ca2+條件下，模型組小鼠冠狀動脈的收縮量效曲線明顯右移。在5-HT和U46619誘導(dǎo)冠狀動脈收縮反應(yīng)中，兩組間的Emax和pEC50均無明顯差異(P>0.05),見Fig 4。

Fig 4 Effect of sarcoplasmic reticulum calcium on concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT and U46619 in coronary arterial rings of diabetic mice Representative recording of 5-HT(A)- and U46619 (C)- elicited concentration-dependent contraction in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. In Ca2+-free buffer, effect of nifedipine (1 μmol·L-1) on concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT (B) and U46619 (D) in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. 5-HT: ncontrol=8, nmodel=8; U46619: ncontrol=7, nmodel=9. **P<0.01 vs control.

Fig 3 Effect of nifedipine on concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT and U46619 in coronary arterial rings of diabetic mice Representative recording of 5-HT(A)- and U46619 (D)- elicited concentration-dependent contraction in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. The effect of nifedipine (1 μmol·L-1) on concentration-dependent vasoconstriction evoked by 5-HT (B) and U46619 (E) in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. The concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT (C) and U46619 (F) inhibited by nifedipine (1 μmol·L-1) in the coronary arterial rings of wild-type and diabetic mice. 5-HT: ncontrol=11, nmodel=9; U46619: ncontrol=10, nmodel=9. **P<0.01 vs control.

4 討論

VSMCs的收縮依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(intracellular calcium concentration，[Ca2+]i)的增加，[Ca2+]i的增加主要通過胞外鈣內(nèi)流和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放介導(dǎo)[5]。細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流途徑主要包括與膜電位有關(guān)的L-型鈣通道以及與鈣庫耗竭有關(guān)的SOC通道[6-7]。本課題組已研究報(bào)道2型糖尿病大鼠主動脈血管收縮反應(yīng)性減弱與L型鈣通道下調(diào)有關(guān)，SOC通道介導(dǎo)的收縮明顯增強(qiáng)[2]；但SOC通道不參與大鼠冠狀動脈的收縮[12]。因此本實(shí)驗(yàn)通過不同血管收縮劑以及信號通路阻斷劑，主要研究在有或無L-型鈣通道介導(dǎo)下糖尿病小鼠冠脈收縮的差異性以及SOC通道和肌漿網(wǎng)鈣釋放功能的變化。

血管收縮劑5-HT和血栓素A2類似物U46619分別作用于VSMCs膜上的5-HT2A受體和血栓烷素(TP)受體[13-14]，通過Gq蛋白激活磷脂酶C(PLC)，促使磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)水解，生成三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)，IP3與肌漿網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合觸發(fā)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放，使膜去極化二次激活L-型鈣通道，同時(shí)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+耗竭可激活SOC通道，使細(xì)胞外鈣內(nèi)流，引起血管收縮；DAG可以通過作用于非選擇性鈣離子通道參與VSMCs收縮，另一方面還可以作用于蛋白激酶C(PKC),增加鈣敏感性促進(jìn)血管收縮[10, 15]。

為了闡明小鼠冠狀動脈收縮的鈣調(diào)控機(jī)制，采用高鉀刺激血管引起收縮，提示L-型鈣通道參與冠脈收縮；在細(xì)胞外液無Ca2+條件下加入硝苯地平阻斷L-型鈣通道介導(dǎo)的血管收縮以及肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑TG進(jìn)行孵育，發(fā)現(xiàn)加入CaCl2未引起冠脈收縮，而此時(shí)介導(dǎo)外鈣內(nèi)流參與血管收縮的途徑為SOC通道，提示SOC通道不參與小鼠冠脈的收縮。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予Caffeine后冠脈急劇收縮，而Caffeine通過誘導(dǎo)肌漿網(wǎng)Ca2+釋放增加[Ca2+]i引起血管收縮，提示肌漿網(wǎng)鈣釋放參與小鼠冠脈收縮。

研究表明，糖尿病對血管平滑肌細(xì)胞的收縮功能產(chǎn)生影響[2-4]，為了闡明糖尿病對小鼠冠狀動脈血管張力的影響，本實(shí)驗(yàn)利用血管收縮劑5-HT和U46619誘導(dǎo)冠脈收縮，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠冠狀動脈收縮反應(yīng)性較對照組明顯減弱，提示糖尿病影響冠狀動脈的收縮。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高鉀刺激糖尿病小鼠冠狀動脈引起的收縮反應(yīng)明顯減弱，而高鉀使VSMCs膜去極化，使與膜電位有關(guān)的L-型鈣通道開放，細(xì)胞外Ca2+流入胞內(nèi)，引起血管收縮，提示糖尿病影響L-型鈣通道介導(dǎo)的血管收縮。為了進(jìn)一步驗(yàn)證糖尿病狀態(tài)下鈣調(diào)控機(jī)制的相關(guān)變化，采用L-型鈣通道阻斷劑硝苯地平進(jìn)行孵育，加入收縮劑誘導(dǎo)血管收縮，發(fā)現(xiàn)硝苯地平對糖尿病組血管收縮反應(yīng)的抑制幅度明顯低于對照組，進(jìn)一步說明糖尿病小鼠冠狀動脈L型鈣通道調(diào)控功能下調(diào)；并且糖尿病組對激動劑誘導(dǎo)的血管收縮明顯低于對照組，提示糖尿病影響非L-型鈣通道介導(dǎo)的血管收縮。隨后，我們探討糖尿病狀態(tài)下肌漿網(wǎng)鈣釋放功能的變化，發(fā)現(xiàn)在含硝苯地平的無鈣K-H溶液中，收縮劑誘導(dǎo)糖尿病組的血管反應(yīng)性明顯低于對照組，提示糖尿病小鼠肌漿網(wǎng)鈣釋放功能下調(diào)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)參與小鼠冠狀動脈平滑肌收縮的鈣調(diào)控機(jī)制主要包括L-型鈣通道和肌漿網(wǎng)鈣釋放，SOC通道不參與其收縮；糖尿病小鼠冠狀動脈對血管收縮劑的反應(yīng)性明顯減弱，與L-型鈣通道和肌漿網(wǎng)鈣釋放功能下調(diào)有關(guān)。此外，Yokota等[16-17]研究表明，糖尿病患者對5-HT和血管緊張素II(Ang II)誘導(dǎo)血管收縮反應(yīng)性增強(qiáng)與VSMCs膜上5-HT2A受體和AT1受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)，糖尿病小鼠冠脈張力的變化是否也與VSMCs膜上相應(yīng)受體的表達(dá)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中未涉及，有待進(jìn)一步研究。