劉威良，黃艾祥

(云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201)

睡眠是人體不可或缺的生命活動之一，猶如進食、進水一樣是一個主動的生理與心理過程，并非疲勞引起的結果[1].國際上公認的健康標準包括適量的運動、飲食的均衡及充足的睡眠，其中睡眠時間占人類一生的三分之一，其對人體健康的維持至關重要.隨著社會的高速發(fā)展，生活壓力劇增，生活節(jié)奏加快，生活習慣的不規(guī)律，導致失眠的發(fā)病率呈逐年上升且趨于低齡化，這一問題引起國內外醫(yī)學界的關注.失眠是指不能正常獲取睡眠的一種病癥，臨床上較為常見并且難以根治，其發(fā)生受諸多因素的影響，但均表現為機體正常睡眠-覺醒節(jié)律的紊亂，繼而引發(fā)神經-內分泌-免疫功能異常，危害人們的身心健康[2].國內外流行病學調查研究表明，平均每3個成年人中存在一人飽受睡眠障礙的困擾，我國大約45.5%的人群存在不同程度的睡眠問題[3].

目前臨床上治療失眠主要依賴于化學類藥物，如苯二氮卓類；褪黑素類受體激動劑催眠藥；非苯二氮卓類及某些有鎮(zhèn)靜作用的抗抑郁藥物等.這些藥物均可通過介導相關神經遞質發(fā)揮中樞鎮(zhèn)靜作用，但易于產生成癮性、戒斷癥狀明顯及藥物依賴性等不良副作用[4].相比西藥，中藥有著毒副作用小、療效高等優(yōu)點，加上我國植物資源豐富，近年來研究發(fā)現，一些藥食同源植物對人體免疫、內分泌、生殖系統(tǒng)疾病等表現出良好的防治作用外，對中樞神經系統(tǒng)亦表現出很好的生理功效，如酸棗仁提取物可通過5-羥色胺能神經系統(tǒng)(5-HTergic)發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用，靈芝提取物可通過γ-氨基丁酸能神經系統(tǒng)(GABAergic)促進睡眠，如今，研究重心逐步轉向從一些藥食同源植物提取物中尋找治療失眠的功能因子[4-7].

苦繩(Dregeasinensis)又稱“小木通、奶漿藤、通關散”，屬蘿藦科(Ascle piadaceae)南山藤屬(DregeaE.Mey.)野生植物資源，廣泛分布于四川、廣西、貴州、云南等地區(qū)的山嶺地帶，至今未見人工培育的種苗[8].貫筋藤為苦繩的一個變種，廣泛分布于云南西北地區(qū)的澄江、麗江、大理和昆明等地的灌木叢或山林中.貫筋藤渾身是寶，其各個器官用熱水蒸煮浸泡后的溶液，可用來制作云南大理一種特色小吃“乳扇”，其鮮葉、花蕾可與辣椒面、豆豉等風味調料一起搭配烹飪食之[9].貫筋藤的干莖是我國傣族醫(yī)藥(傣百解膠囊)的一味藥材，用于治療癰瘡癤腫，風濕弊痛，咳嗽痰喘等病癥[10].古代醫(yī)藥專著記載貫筋藤可祛風濕止痛、平喘止咳、通經下乳，用以醫(yī)治風濕痹痛、肺熱咳喘、跌打損傷、小兒驚風抽搐等病癥[11].現代藥理學研究表明，貫筋藤富含黃酮、多糖、甾體皂苷及蛋白質等活性成分，其生理功效有抗抑郁、抗癲癇、抗糖尿病、神經保護、肝保護、免疫調節(jié)及抗癌等[12-14].目前對貫筋藤的研究多集中于其活性物質的萃取、分離及結構鑒別等方面[15-17].國內學者黃艾祥等[18]研究發(fā)現，貫筋藤中的蛋白酶類物質是一種天然、高效及安全的凝乳劑，可用于食品加工，工業(yè)絮凝劑生產等.有關貫筋藤鎮(zhèn)靜催眠作用的研究未見報道，本試驗采用相關藥理學研究模型，初步探討貫筋藤水提物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用，為其改善睡眠功能性食品、藥品、保健品的研發(fā)提供科學依據，并拓展資源的利用空間.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 貫筋藤鮮莖采自云南麗江永勝縣，海拔1 500～3 500 m灌木叢或山林中.

1.1.2 試驗動物 SPF級ICR小鼠，雄性，體質量18～22 g，采購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證為：SCXK(湘)2016-0002.

1.2 試驗試劑及儀器

1.2.1 試驗試劑 戊巴比妥鈉(Sigma，上?；瘜W試劑分裝廠進口分裝，批號：F20160721)；艾司唑侖片(華中藥業(yè)股份有限公司，批號：20180605)；戊四氮(天津希恩思生化科技有限公司，批號：20180915)；士的寧(四川維克奇生物科技有限公司，批號：20180712)；印防己毒素(上海麥克林生化科技有限公司，批號：20180823)；羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20170909)；二甲基亞砜(Sigma，批號：D2650)；生理鹽水(廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司，批號：20181107)；所用其他試劑均為分析純.

1.2.2 試驗儀器 YLS-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)；HH-6數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；RE520旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Scientz-500C多功能恒溫超聲萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；400Y多功能粉碎機(浙江永康市鉑歐五金制品有限公司)；CP153電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；LC-162C海爾冰箱(青島海爾集團)；秒表(深圳市惠波工貿有限公司).

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 貫筋藤水提物：稱取1 kg貫筋藤干莖，粉碎，加入20倍體積的蒸餾水，100 ℃回流提取3次 ，每次2 h,過濾、離心，合并3次濾液，上旋轉蒸發(fā)儀濃縮至相當于原生藥量1 g/mL的藥液，分裝于無菌試管中，-20 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆茫褂脮r用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成懸浮液[19].

1.3.2 對小鼠自發(fā)活動的影響[20]按照《中藥新藥臨床研究指導原則 》劑量選擇的方法，將人用劑量折算成小鼠給藥劑量，將小鼠隨機分為5個組，確保組間體質量無顯著性差異(P>0.05)，每組11只小鼠，即貫筋藤水提物高劑量組(2 g/kg)、中劑量組(1 g/kg)、低劑量組(0.5 g/kg)、艾司唑侖片組(2 mg/kg)、空白組，各組均灌胃給藥，其中空白組灌胃給予0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液(給藥量為20 mL/kg).每日灌胃一次，每日上午8∶00～10∶00給藥，連續(xù)給藥7 d，給藥期間觀察各組小鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲食與糞便有無異常，于末次給藥后30 min，將小鼠放入自主活動記錄儀的小室內，適應環(huán)境3 min，然后用自主活動儀連續(xù)記錄5 min內小鼠自主活動次數.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.3.3 對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠作用的影響[21]

1.3.3.1 對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠率的影響 取55只小鼠，分組給藥，方法同1.3.2.末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾下劑量(30 mg/kg)，以小鼠翻正反射消失1 min以上者則記為入睡，觀察并統(tǒng)計注射戊巴比妥鈉后15 min內各組小鼠的入睡百分比.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.3.3.2 對閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響 取55只小鼠，分組給藥，方法同1.3.2.末次給藥30 min后腹腔注射戊巴比妥鈉溶液閾劑量(50 mg/kg)，用秒表觀察并記錄小鼠睡眠潛伏期(從注射戊巴開始至小鼠翻正反射消失的時間)和睡眠持續(xù)時間(從小鼠翻正反射消失至恢復正常活動的時間).為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.3.4 對戊四唑誘導驚厥的影響[22]取55只小鼠，分組給藥，方法同1.3.2.末次給藥30 min后腹腔注射戊四唑溶液(85 mg/kg)，觀察并記錄各組小鼠驚厥及死亡情況.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.3.5 對印防己毒素誘導驚厥的影響[23]取55只小鼠，分組給藥，方法同1.3.2.末次給藥30 min后腹腔注射印防己毒素溶液(10 mg/kg)，觀察并記錄各組小鼠驚厥及死亡情況.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.3.6 對士的寧誘導驚厥的影響[24]取55只小鼠，分組給藥，方法同1.3.2.末次給藥30 min后腹腔注射士的寧溶液(1.6 mg/kg)，觀察并記錄各組小鼠驚厥及死亡情況.為減小系統(tǒng)誤差，所有試驗均采用平行操作.

1.4 統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 對小鼠自主活動的影響

本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯抑制小鼠的自主活動次數，且具有非常顯著的差異(P<0.001)；貫筋藤水提物高、中、低劑量組均能不同程度抑制小鼠的自主活動次數，且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明其具有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用；與艾司唑侖組比較，貫筋藤水提物各劑量組均無統(tǒng)計學意義，結果見表1.

表1 貫筋藤水提物對小鼠自主活動的影響

2.2 對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠作用的影響

2.2.1 對閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠率的影響 本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致的睡眠小鼠的數量，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；貫筋藤水提物高、中、低劑量組均能不同程度的增加閾下劑量戊巴比妥鈉所致的睡眠小鼠的數量，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，表明其對戊巴比妥鈉誘導的睡眠有一定的協同作用，結果見表2.

表2 貫筋藤水提物對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠小鼠的影響

2.2.2 對閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響 本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠的入睡潛伏期時間，延長小鼠睡眠時間，且具有非常顯著的差異(P<0.001)；貫筋藤水提物各劑量組均能不同程度地縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠的入睡潛伏期時間，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，同時明顯延長小鼠睡眠時間，且具有非常顯著的差異(P<0.001)，表明其具有協同戊巴比妥鈉促進動物睡眠的效果，結果見表3.

表3 貫筋藤水提物對閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的影響

2.3 對戊四唑誘導驚厥的影響

本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低戊四氮致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；貫筋藤水提物各劑量組均能不同程度地降低戊四氮致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，表明其對中樞興奮劑戊四唑有一定的拮抗作用，結果見表4.

表4 貫筋藤水提物對戊四唑誘導小鼠驚厥的影響

2.4 對印防己毒素誘導驚厥的影響

本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低印防己毒素誘導小鼠驚厥的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；貫筋藤水提物各劑量組均能不同程度地降低印防己毒素致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，表明其對中樞興奮劑印防己毒素有一定的拮抗作用，結果見表5.

表5 貫筋藤水提物對印防己毒素誘導小鼠驚厥的影響

2.5 對士的寧誘導驚厥的影響

本研究顯示，連續(xù)給藥7 d后，與空白對照組比較，艾司唑侖組明顯降低士的寧誘導小鼠驚厥的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；貫筋藤水提物各劑量組均能不同程度地降低士的寧致驚厥小鼠的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，表明其對中樞興奮劑士的寧有一定的拮抗作用，結果見表6.

表6 貫筋藤水提物對士的寧誘導小鼠驚厥的影響

3 討論

失眠是困擾現代人最長見的病癥之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且趨于低齡化.一些藥食同源植物提取物因其毒副作用小及在鎮(zhèn)靜催眠方面表現出良好的效果，備受廣大研究者們青睞[25].

睡眠是一個涉及多系統(tǒng)、多中樞、較為復雜的生理過程，長期以來人們對鎮(zhèn)靜催眠類藥物研究的方法不盡相同，但大體上趨向一致，其中動物自主活動試驗是評估精神類藥物最為常用、方便的試驗方法，它能很好地反映中樞神經系統(tǒng)功能狀態(tài)(興奮或抑制)，是一項重要的檢測指標[26].本試驗結果表明，貫筋藤提取物不同劑量組均能顯著減少小鼠自主活動，可降低大腦皮層興奮性，具有一定的中樞鎮(zhèn)靜作用，且呈現出量效關系.戊巴比妥鈉是巴比妥類催眠藥，常應用于動物麻醉試驗中，其作用機制與GABAA受體有關，藥理學試驗研究中常利用藥物與戊巴比妥鈉的協同作用來評價鎮(zhèn)靜催眠作用情況[27].戊巴比妥鈉主要通過肝藥酶進行代謝，若所篩藥物對肝藥酶有抑制作用，也可以延長戊巴比妥鈉所致實驗動物的睡眠時間，因此，采用戊巴比妥鈉閾下劑量進行實驗排除此類影響[28].本研究數據顯示，貫筋藤水提物不同劑量組均能明顯提高小鼠的入睡率、顯著縮短閾劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠潛伏期并延長其睡眠持續(xù)時間，具有協同戊巴比妥鈉催眠作用，且呈現出劑量依賴關系，其發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用的機制可能與GABAA受體有關.甘氨酸(Glycin)和γ-氨基丁酸(GABA)是大腦內重要的抑制性氨基酸，其對中樞神經系統(tǒng)興奮與抑制穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)揮著重要調控作用[29].戊四唑，又稱戊四氮，是GABA受體拮抗劑，主要的作用部位是腦干和大腦，增強興奮性突觸的易化過程，引發(fā)驚厥的產生，臨床上主要用于解救麻醉藥及巴比妥類藥物中毒，動物實驗中常作為一種驚厥反應的誘導劑[30].印防己毒素是一種非競爭性離子通道阻斷劑，作用于GABAA受體，劑量過大可導致大腦中樞神經和脊髓神經過度興奮引發(fā)驚厥，臨床上用于解救巴比妥類藥物中毒，屬于作用偏強的中樞興奮劑[31].士的寧又稱番木鱉堿，是從我國傳統(tǒng)中藥馬錢子中提取出來的一種生物堿，為中樞神經系統(tǒng)內抑制性氨基酸甘氨酸(Glycin)受體拮抗劑，其通過選擇性阻斷Glycin受體，提高骨骼肌的緊張度，劑量過大時可誘導強直性驚厥的發(fā)生，臨床上用于治療弱視、偏癱、巴比妥類藥物中毒、血液病以及鏈霉素的毒性反應[32-33].本試驗數據顯示，貫筋藤提取物各劑量組均能不同程度地降低不同藥物誘導小鼠驚厥的死亡率，且具有統(tǒng)計學差異，表明其可能通過作用于Glycinergic及GABAergic通路，發(fā)揮中樞鎮(zhèn)靜作用，具體作用機制有待進一步考察.

4 結論

綜上所述，本研究采用小鼠自主活動、藥物與戊巴比妥鈉協同作用及對抗中樞興奮劑等經典的鎮(zhèn)靜催眠模型綜合評價藥物的中樞鎮(zhèn)靜作用，初步考察了不同給藥劑量的貫筋藤提取物對小鼠鎮(zhèn)靜催眠及對抗中樞興奮劑誘導的驚厥作用，結果表明其能夠降低正常小鼠的自發(fā)活動、對戊巴比妥鈉促進動物睡眠有一定的協同促進作用、對各種致驚厥劑誘導的驚厥反應有很好的對抗效果，這可能與其富含黃酮、皂苷等活性成分通過多靶點、多途徑發(fā)揮中樞鎮(zhèn)靜作用有關，具體是哪一種活性成分發(fā)揮作用及其促睡眠機制有待后期考察.