常 翔，楊 琳，李 敏，雷亞玲

（1.西安市中醫(yī)醫(yī)院，西安 710021；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710000）

當(dāng)歸芍藥散出自張仲景所著《金匱要略》，由當(dāng)歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)、澤瀉6 味藥組成，早先主要應(yīng)用于婦科痛證的治療。20 世紀(jì)80 年代末，日本學(xué)者水島宣昭[1]報道了當(dāng)歸芍藥散改善阿爾茲海默?。ˋD）病人臨床癥狀，受到廣泛關(guān)注。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，在吞噬清除腦內(nèi)有害物質(zhì)和凋亡神經(jīng)細(xì)胞等方面扮演著重要的角色[2-3]，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一道免疫防線。近年來多項研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞參與了AD 的發(fā)生和發(fā)展，其活化后可以通過吞噬作用及時清除腦內(nèi)的β 淀粉樣蛋白（Aβ），防止AD 的發(fā)生和發(fā)展，而它對Aβ 的吞噬功能與其活化狀態(tài)密切相關(guān)。本研究應(yīng)用當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察不同濃度的當(dāng)歸芍藥散對小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖作用，以及對其活化狀態(tài)的影響，探討當(dāng)歸芍藥散治療AD 的作用機(jī)制。報道如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞 選用永生化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2 細(xì)胞，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理所饋贈。

1.2 試劑 MEM 培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清、青霉素/鏈霉素（pen-Strep）、0.25%胰蛋白酶，均購自Gibco公司；CCK-8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Biosharp公司；Trizol 試劑購自Aidlab 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒購自Vazyme 公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿等購自中國國藥集團(tuán)。

1.3 當(dāng)歸芍藥散制備 制備當(dāng)歸芍藥散最佳劑量提取物：按《金匱要略》原文比例，即當(dāng)歸:芍藥:川芎:茯苓:白術(shù):澤瀉=3:16:8:4:4:8，共860 g，用超純水冷凝回流提取2 次，每次提取1 h，2 次用水量與藥材的比例為1:8 和1:6（w/v）；收集2 次的提取液，60 ℃濃縮至約800 mL，得含生藥量為1.075 g/mL 的母液，4 ℃保存?zhèn)溆?；給藥時稀釋母液至生藥含量為0.64 g/mL 的當(dāng)歸芍藥散最佳劑量水提物。

1.4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清制備 取昆明小鼠，正常對照組予生理鹽水灌胃，當(dāng)歸芍藥散高劑量組予當(dāng)歸芍藥散 6.4 g/（kg·d） 灌胃，當(dāng)歸芍藥散低劑量組予當(dāng)歸芍藥散 3.2 g/（kg·d） 灌胃，共給藥1 周，實驗結(jié)束后處死小鼠取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。所有動物每次灌胃量均?.2 mL/10 g 計，每日給藥1 次。

1.5 儀器與設(shè)備 CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO，MCO-15AC），倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX51），酶標(biāo)儀（Thermo，MULTISKAN MK3），低速離心機(jī)（Eppendorf，5702R），超凈工作臺（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司），實時熒光定量PCR 儀（ABI，QuantStudio 6），水平電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY300），紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，JY02S）。

2 方法

2.1 BV2 細(xì)胞培養(yǎng) 以 MEM +10% FBS+1% (Penicillin-Streptomycin Solution)配制細(xì)胞培養(yǎng)液，將BV2 細(xì)胞從液氮中取出，快速溶解后洗滌、離心，懸浮細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)基中，接種到培養(yǎng)皿中混勻，37 ℃ 5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁的密度達(dá)到80%時，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞1～2 min，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行后續(xù)各項實驗。

2.2 CCK8 實驗測定當(dāng)歸芍藥散對BV2 細(xì)胞活力的影響 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的BV2 細(xì)胞，按5×103個/孔密度接種于96 孔板中，每孔加入培養(yǎng)液200 μL，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；按照如下分組對細(xì)胞進(jìn)行處理：正常組（不含當(dāng)歸芍藥散含藥血清）、當(dāng)歸芍藥散低劑量組[3.2 g/（kg·d）]、當(dāng)歸芍藥散高劑量組[6.4 g/（kg·d）]，作用時間：12 h、24 h、48 h；細(xì)胞培養(yǎng)所需時間后，每孔加入20 μL cck8，37 ℃ 培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀測定各孔吸光值OD 450。每組設(shè)3 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

2.3 Real-time PCR 檢測當(dāng)歸芍藥散對TNF-α、Arg1 mRNA 表達(dá)影響 采用Trizol 法提取RNA，用微量分光光度計測定樣品RNA 的濃度和純度，隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，應(yīng)用SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Real-time PCR 反應(yīng)根據(jù)以下條件擴(kuò)增：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 sec，60 ℃ 30 sec，40 個循環(huán)。Real-time PCR 引物具體見表1，采用ABI Prism7300 SDS software 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以GAPDH 作為內(nèi)參比較目的基因的表達(dá)高低。

表1 Real-time PCR 引物

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸芍藥散對BV2 細(xì)胞活力的影響 應(yīng)用不同濃度的當(dāng)歸芍藥散含藥血清分別干預(yù)BV2 細(xì)胞12 h、24 h、48 h，以相應(yīng)濃度的DMSO 作為空白對照組，采用CCK-8 檢測BV2 細(xì)胞的活力。實驗結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散含藥血清在12、24、48 h 3 個時間點均可促進(jìn)BV2 細(xì)胞增殖，且細(xì)胞增殖能力隨著劑量增加而增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1；不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清血清干預(yù)BV2 細(xì)胞后，隨著時間延長，細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步提高，且干預(yù)達(dá)到48 h 后，較之干預(yù)12 h 后有顯著差異，見圖2，提示當(dāng)歸芍藥散可顯著增強BV2 細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)一定的劑量、時間依賴性。

3.2 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響 應(yīng)用不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)BV2 細(xì)胞后，采用Real-time PCR 法檢測BV2 細(xì)胞內(nèi)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示：當(dāng)歸芍藥散可下調(diào)TNF-α mRNA 表達(dá)水平，可能抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)化，見圖3。

圖1 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對BV2 細(xì)胞活力的影響

圖2 不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清對BV2 細(xì)胞活力的影響

圖3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對TNF-α mRNA 表達(dá)的影響

3.3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響 應(yīng)用不同濃度當(dāng)歸芍藥散含藥血清干預(yù)BV2 細(xì)胞后，采用Real-time PCR 法檢測BV2 細(xì)胞內(nèi)M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 的mRNA 表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示，當(dāng)歸芍藥散可上調(diào)Arg1 mRNA 表達(dá)水平，可能促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化，見圖4。

圖4 當(dāng)歸芍藥散含藥血清對Arg1 mRNA 表達(dá)的影響

4 討論

當(dāng)歸芍藥散早先主要應(yīng)用于婦科痛證的治療，主治妊娠“腹中疼痛”及婦人雜病“腹中諸疾痛”[4-5]。方中芍藥養(yǎng)血、川芎活血、當(dāng)歸兼具活血養(yǎng)血；配以茯苓、白術(shù)、澤瀉健脾滲濕[6-7]。當(dāng)歸芍藥散活血養(yǎng)血、健脾利濕，具有補本虛、祛標(biāo)實的特點，全方補中寓瀉，又瀉中求補。癡呆的中醫(yī)病機(jī)為本虛標(biāo)實，本虛主要為腎精虧損、氣血不足，標(biāo)實主要為痰濁阻竅、氣滯血瘀，故當(dāng)歸芍藥散目前也被應(yīng)用于AD 的治療和研究。多位學(xué)者[8-11]曾報道當(dāng)歸芍藥散治療癡呆的臨床觀察，反復(fù)驗證其治療AD 的有效性。同時，大量動物實驗研究[12-15]也證明了當(dāng)歸芍藥散能夠改善AD 模型動物的認(rèn)知功能障礙。

目前研究認(rèn)為，腦內(nèi)大量的β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉積是AD 特殊的病理改變之一。在病理過程中，Aβ 產(chǎn)生和清除失衡導(dǎo)致Aβ 聚集成具有神經(jīng)毒性的可溶性寡聚體，在記憶相關(guān)的腦區(qū)域過度沉積，引起腦內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡等一系列事件，最終導(dǎo)致AD 發(fā)生。因此，有學(xué)者[16]認(rèn)為促進(jìn)Aβ 清除可有效干預(yù)和阻斷AD 進(jìn)程，進(jìn)而提出以調(diào)控Aβ 清除為治療AD 的核心策略。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，大腦細(xì)胞中如出現(xiàn)異常，如神經(jīng)細(xì)胞死亡或蛋白聚集，小膠質(zhì)細(xì)胞則轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)遷移到受損區(qū)域進(jìn)行免疫應(yīng)答。然而，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞對于AD 而言是一把雙刃劍，對Aβ 的吞噬功能與其活化狀態(tài)相關(guān)。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞呈過度活化狀態(tài)，主要分泌促炎因子如IL-1β、TNF-α，而不具備吞噬Aβ 的作用，進(jìn)而加劇惡化AD 進(jìn)程；M2 型是一種限制性激活狀態(tài)，分泌較多抗炎因子如IL-10、IL-4 等，并且能夠通過吞噬作用清除Aβ[17]。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，促進(jìn)其對Aβ 的吞噬作用，可能是防治AD 的一條重要途徑。

本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸芍藥散含藥血清可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、使細(xì)胞活力增強，并呈現(xiàn)出一定的時間、劑量依賴性；當(dāng)歸芍藥散下調(diào)了M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平，上調(diào)了M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Arg1 的mRNA 表達(dá)水平，說明當(dāng)歸芍藥散可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的有效活化，使其發(fā)揮免疫應(yīng)答作用，且當(dāng)歸芍藥散可能調(diào)控了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，抑制其向M1 型活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化，而促進(jìn)了向M2 型活化狀態(tài)的轉(zhuǎn)化，使其趨利避害，從而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ 的吞噬作用，在一定程度上保護(hù)神經(jīng)元，起到積極干預(yù)AD 的作用。