周陽 費明明 黃左安

摘要：熒光定量PCR（RT-PCR）檢測方法作為檢測SARS-CoV-2的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用于臨床。但由于標(biāo)本病毒載量不同和RT-PCR的局限性，不可避免的會出現(xiàn)大量的假陰性報告，導(dǎo)致無法及時診斷、早期治療、阻斷傳播、評估出院標(biāo)準(zhǔn)等問題。為了改善這一情況，我們探索了一種基于數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)的檢測SARS-CoV-2的方法。首先，使用新型冠狀病毒數(shù)字PCR核酸檢測試劑盒定量三例強陽咽拭子樣本ORF1ab基因拷貝數(shù)，并與RT-PCR的Ct值進行分析，發(fā)現(xiàn)二者呈對數(shù)相關(guān)性。隨后挑選1例陽性樣本，進行倍比稀釋檢測，最終確定其檢測試劑盒的最低檢出限為250 copies/ml，遠(yuǎn)低于RT-PCR的1000 copies/ml。使用60例稀釋至250 copies/ml對試劑盒檢出限進行驗證，發(fā)現(xiàn)ORF1ab基因檢出率為93.3%，N基因檢出率為100%。臨床驗證結(jié)果顯示在檢測的15例臨床樣本，其中8例RT-PCR診斷為疑似的樣本，ddPCR結(jié)果5例是陽性，3例是陰性。因此，ddPCR在臨床診斷SARS-CoV-2具有更高的靈敏度，減少了假陰性和假陽性診斷，對COVID-19診斷、治療和防控等方面均具有重要意義。

關(guān)鍵詞：SARS-CoV-2;COVID-19;核酸檢測;RT-PCR;ddPCR

【中圖分類號】R563.1 ?【文獻標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2020）08-217-03

1.引言

2019年12月，湖北武漢爆發(fā)不明原因肺炎，并迅速在全國蔓延。目前，COVID-19的檢測主要有CT檢查[1]，核酸檢測[2，3]和抗體檢測[4-6]。熒光定量PCR已經(jīng)成為實驗室檢測SARS-CoV-2病毒核酸的主要方式[7]，然而，核酸檢測結(jié)果受到樣本和取樣時間的影響，存在假陰性情況[3，8，9]，原因之一可能是樣本的病毒載量未達到試劑的最低檢出限。尋找具有更低檢出限的核酸檢測方法，成為了臨床檢測COVID-19的重要目標(biāo)。

微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）是一種將模板稀釋到單分子水平并結(jié)合泊松分布定量DNA分子的方法[10]。與實時熒光定量PCR相比，它提供了更高的靈敏度和特異性。因此，本研究基于ddPCR技術(shù)，評估了RT-PCR檢測與ddPCR檢測新冠病毒的靈敏度與特異性，確定一種高靈敏的檢測方法，以期降低臨床檢測的假陰性率。

2.材料方法

2.1材料

鼻咽拭子樣本共118份，其中陰性樣本101份，陽性樣本9份，疑似樣本8份，由中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院提供;核酸提取或純化試劑（Ex-DNA/RNA病毒）、全自動旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀（GeneRotex 96）購自蘇州天隆生物科技有限公司;數(shù)字PCR微滴式芯片（V2）、新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（數(shù)字PCR法）、樣本制備儀（DG32）、PCR擴增儀（TC1）、生物芯片閱讀儀（iScanner5）由領(lǐng)航基因科技（杭州）有限公司提供。新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司。全自動定量PCR儀（SLAN-96S）購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

2.2實驗方法

2.2.1核酸提取

取出-80℃冰箱保存的鼻咽拭子樣本，室溫融化，渦旋震蕩混勻。取出核酸提取和純化試劑，將深孔板顛倒混勻，重懸底部磁珠，輕甩孔板，使試劑及磁珠集中到底部，撕開封口膜。深孔板第一孔加入20ul蛋白酶K和200ul鼻咽拭子樣本，第二孔放入攪拌套。加完樣本后的孔板放入全自動旋轉(zhuǎn)式核酸提取儀中，按照說明書的程序提取病毒核酸。取出最后一孔中的核酸樣本到1.5ml無RNA酶的EP管中，-80℃保存。

2.2.2數(shù)字PCR擴增及芯片閱讀

預(yù)熱樣本制備儀、生物芯片閱讀儀。取出-20℃冰箱保存的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（數(shù)字PCR法），冰上溶解ddPCR試劑。在生物安全柜中按照說明書配制反應(yīng)體系，取14ul反應(yīng)體系加入到數(shù)字PCR微滴式芯片進樣口的杯子中，加入16ul油相補滿。在進出口杯子上蓋上硅膠帽，放入樣本制備儀制備微滴。微滴制備完成后，將芯片放入PCR擴增儀中，按照程序擴增。取出擴增完成的芯片，放入生物芯片閱讀儀掃描并記錄結(jié)果。

2.2.3RT-PCR擴增

取出-20℃冰箱保存的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），冰上溶解RT-PCR試劑。在生物安全柜中按照說明書在八連管中配制反應(yīng)體系。將八連管放入全自動定量PCR儀中，按照程序擴增并觀察結(jié)果。

2.2.4陽性樣本定量

挑選3個qPCR檢測結(jié)果為強陽性的樣本，用陰性稀釋液稀釋陽性樣本的核酸，梯度為1，10，100倍稀釋。取200ul樣本，使用核酸提取或純化試劑提取樣本核酸，重復(fù)2次。提取的核酸進行數(shù)字PCR ORF1ab單基因定量，計算原始樣本病毒拷貝數(shù)。

計算公式：

Y：原始樣本病毒核酸拷貝數(shù);D：稀釋倍數(shù);S：提取樣本量;E提取后核酸體積;T：反應(yīng)核酸體積;R：反應(yīng)體系體積;Q：定量拷貝數(shù)。

2.2.5線性化驗證

取2.2.5的陽性核酸樣本，直接進行RT-PCR檢測。通過GraphPad軟件對數(shù)據(jù)進行線性分析，X為RT-PCR檢測的Ct值，Y為Log10ddPCR定量的核酸數(shù)值，P < 0.05認(rèn)為有意義。

2.2.6最低檢出限確定

取1例定量后的陽性樣本，用陰性稀釋液，采用倍比稀釋法將樣本核酸拷貝數(shù)稀釋到2000，1000，500，250 copies/ml，各三份。使用核酸提取或純化試劑提取各樣本核酸并收集。提取的核酸樣本使用數(shù)字PCR核酸檢測試劑盒進行ORF1ab和N基因雙基因擴增檢測。根據(jù)檢出結(jié)果，確定最低檢出限。

2.2.7最低檢出限驗證

取3例定量后的陽性樣本，用陰性稀釋液稀釋到最低檢出限的基因拷貝數(shù)，各20份。核酸提取或純化試劑提取樣本核酸并收集，使用數(shù)字PCR核酸檢測試劑盒進行ORF1ab和N基因雙基因擴增檢測。檢出率 > 90% 則認(rèn)為該拷貝濃度是最低檢出限。

2.2.8臨床樣本驗證

取15例RT-PCR檢測后的樣本，1例為陰性，6例為陽性，8例為疑似陽性。樣本核酸使用ddPCR進行OFR1ab和N基因雙基因擴增檢驗，觀察檢出效果。

2.3實驗結(jié)果

2.3.1陽性樣本定量結(jié)果

以10倍稀釋的樣本ORF1ab檢出數(shù)值預(yù)估原樣本的濃度。樣本A為7.5×106 copies/ml;樣本B為1.1×107 copies/ml;樣本C為3.0×107 copies/ml。

2.3.2線性化驗證

提取的核酸進行RT-PCR檢測，以Log10拷貝數(shù)和RT-PCR的Ct值進行比對，通過GraphPad軟件分析二者結(jié)果是否呈線性相關(guān)，如圖1所示。

從圖1可以看出，ddPCR定量的SARS-CoV-2病毒ORF1ab拷貝數(shù)與RT-PCR檢測的Ct值線性相關(guān)，且p值小于0.0001。

2.3.3最低檢出限確定及驗證

樣本在2000，1000，500 copies/ml時，兩個基因的檢出率為100%，250 copies/ml，有一個樣本的ORF1ab基因未檢測到。因此最低檢出限在500copies/ml和250 copies/ml兩個濃度中產(chǎn)生。

取ABC三個樣本，用陰性稀釋液稀釋到250 copies/ml，各20份樣本，進行核酸提取和數(shù)字PCR檢測，結(jié)果見表1。N基因的檢出率為100%，ORF1ab的檢出率為93.3%?？梢源_定該試劑盒的最低檢出限為250 copies/ml。

2.3.4臨床樣本驗證

取RT-PCR檢測陽性，弱陽性，陰性樣本共15例，進行ddPCR檢測，見表2。樣本1 RT-PCR和ddPCR檢測都為陰性;樣本2-7，二者都為陽性，樣本8-10 RT-PCR結(jié)果為疑似，ddPCR結(jié)果為陰性。樣本11-15 RT-PCR結(jié)果為疑似，ddPCR結(jié)果為陽性，結(jié)果見表2。

2.4討論

本研究使用領(lǐng)航基因生產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（數(shù)字PCR法）以及相配套的儀器，對3例陽性病人鼻咽拭子樣本進行絕對定量。通過對比ddPCR定量結(jié)果和RT-PCR的Ct值確定二者呈線性相關(guān)（圖1）。隨后，選取1例陽性樣本進行梯度稀釋，測得ddPCR最低檢出限為250 copies/ml，并用其他2例樣本進行驗證，ORF1ab基因檢出率為93.3%，N基因檢出率為100%。目前市場上的RT-PCR試劑盒檢出限基本為1000 copies/ml[11]，但患者的許多樣本病毒含量達不到該檢出限[12]。另外，筆者對15例樣本進行臨床樣本，表2的結(jié)果顯示有8例RT-PCR結(jié)果為疑似的樣本，其中5例樣本ddPCR的結(jié)果為陽性，3例為陰性，這表明ddPCR在檢測低病毒載量樣本方面更具有優(yōu)勢，減少假陰性和假陽性結(jié)果。這也與Suo[13]和Yu[14]等人的研究結(jié)果一致。隨著新冠疫情在全球愈演愈烈，國際對于新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒需求急劇上升。

越來越多基于RT-PCR的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒被開發(fā)并上市，以滿足臨床大規(guī)模分子診斷的需要。目前為止，RT-PCR仍是COVID-19確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但是，受限于檢測靈敏度不足，在檢測病毒含量低的樣本時無法檢出信號，常導(dǎo)致假陰性的診斷結(jié)果[15]。目前市面上新冠核酸數(shù)字PCR試劑盒僅限用于科研，還未用于臨床診斷。本研究中對比了RT-PCR和ddPCR兩種檢測方法對于SARS-CoV-2的檢測靈敏度，研究表明，ddPCR能夠檢出相對較低的病毒載量樣本，因此，在新冠病毒的檢測中，利用ddPCR技術(shù)，能夠有效降低樣本假陰性和假陽性的產(chǎn)生，是核酸檢測的一個重要補充方法，對COVID-19的確診以及后續(xù)治療效果驗證具有重要意義。

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作者簡介：周陽：碩士，中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院

*通訊作者：張順，蔡挺

資助項目華美基金，項目編號2020HMZD28;基于數(shù)字PCR技術(shù)的新型冠狀病毒（COVID-19）高靈敏診斷平臺，2020YJY0205