楊雨 劉國濤 靳前龍

摘 要：利用三酶復(fù)合法將大豆蛋白水解，然后進行乳酸發(fā)酵，研制成新型大豆多肽酸奶。通過酶解條件的研究，確定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶三者的最佳酶解條件，再將3種酶復(fù)合，采用正交實驗的方法，其最佳酶解工藝最終得出結(jié)論為：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間4h，反應(yīng)pH為6.5。同時確定最佳發(fā)酵條件：溫度38℃，反應(yīng)接種量4%，發(fā)酵時間5h，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌菌種比為1∶1。確定最佳的產(chǎn)品配方：蔗糖6%，乳粉4%，穩(wěn)定劑0.9%。

關(guān)鍵詞：大豆多肽;酶解工藝;復(fù)合蛋白酶;發(fā)酵

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030015

1 材料與方法

總體工藝流程[1]：挑選大豆→浸泡→脫皮→磨漿→熱處理→過濾除渣→加蛋白酶→水解→酶滅活（80℃，15min）→均質(zhì)→調(diào)配→接種乳酸菌→發(fā)酵。

1.1 主要材料

大豆：安陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，顆粒飽滿，無蟲蛀和霉變。

蛋白酶：木瓜蛋白酶（80萬U·g-1）、中性蛋白酶（10萬U·g-1）、菠蘿蛋白酶（50萬U·g-1）。

全脂乳粉：市售。

蔗糖：市售，干燥潔凈，顆粒晶體狀。

穩(wěn)定劑：食品級，奶味飲料穩(wěn)定劑。

菌種：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermopHillus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）。

1.2 主要試劑

20%甲醛溶液（預(yù)先中和）分析純，標準0.05mol·L-1NaOH溶液，0.25%的NaHCO3液體，0.05mol·L-1檸檬酸，其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

精密pH計（酸度計），意大利哈納;JM 85A型膠體磨，山東省萊州市順通膠體磨廠;DM-2100AⅢ自分渣磨漿機，河北滄州鐵獅磨漿機械有限公司;HH—6電熱恒溫水浴鍋，河南智誠科技發(fā)展公司;YB881—4電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，蘇州豪順自動化設(shè)備有限公司;DPH-9012/9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒;BYC—A電子計重天平，深圳市博佳電子儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器，金壇市富華儀器有限公司。1.4 試驗方法

1.4.1 水解度（DH）的測定[2]

用甲醛滴定法測定，公式：

水解度（DH%）=（打斷肽鍵的數(shù)目/總肽鍵數(shù)）×100;水解度（DH）=（水解后生成的NH2基的量/樣品總含N量）×100%

1.4.2 水解后生成的NH2基的測定

由甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由凱氏定氮法測定。

1.4.3 酸度的測定

用指示劑法測定食品中總酸（以乳酸計）。

1.4.4 三酶復(fù)合水解條件的確定[4-7]

采用正交實驗方法，以水解度為測定指標，考察復(fù)合酶比例（A）、反應(yīng)pH值（B）、反應(yīng)溫度（C）和反應(yīng)時間（D）4個因素對水解度的影響。實驗方案如表1。

1.4.5 乳酸菌發(fā)酵條件的確定[1，8]

采用正交實驗法，以酸度（以乳酸計）為測定指標，酸度影響產(chǎn)品的色、香、味和穩(wěn)定性，因此能更好的反映發(fā)酵的適宜條件[3]?？疾旆磻?yīng)溫度（A）、接種量（菌種占大豆蛋白水解液百分比）（B）和反應(yīng)時間（C）3因素對發(fā)酵酸度的影響。實驗方案如表2。

1.4.6 產(chǎn)品配方優(yōu)選實驗

由5～8人組成感官評定小組，根據(jù)產(chǎn)品的粘稠度、清液析出狀況、色澤、酸度、甜度、香味等方面的情況進行感觀評分，采取10分制[8]。產(chǎn)品配方優(yōu)選正交實驗因素水平表如表3。發(fā)酵酸豆乳配方優(yōu)選產(chǎn)品感官評定標準如表4。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆蛋白液最佳水解條件的確定

采用單因素試驗分析方法對3種酶的可控因素進行數(shù)據(jù)分析，以水解度為測定指標，考察其各自的蛋白酶用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和反應(yīng)pH值4個因素對水解度的影響，確定可控因素的最佳范圍。

2.1.1 中性蛋白酶水解的單因素分析

2.1.1.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至7.0，分別加入500U·g-1、1000U·g-1、1500U·g-1、2000U·g-1、2500U·g-1中性蛋白酶，55℃下反應(yīng)3h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖1所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為2000U·g-1時最高。這主要是因為由于酶濃度過大發(fā)生自溶（自水解）現(xiàn)象，導(dǎo)致對底物水解作用減弱[9]。因此，最適酶用量為2000U·g-1。

2.1.1.2 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至7.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，分別在以下溫度中進行反應(yīng)：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，反應(yīng)時間3h，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。

結(jié)果如圖2所示，隨反應(yīng)溫度的增加，在55℃時DH最高。溫度對酶促反應(yīng)的影響有2個方面，溫度提高可使反應(yīng)速度加快，隨著溫度的提高，酶失活速度也開始加快。因此，適宜反應(yīng)溫度為55℃。

2.1.1.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至7.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。

結(jié)果如圖3所示，隨著反應(yīng)時間的逐漸增加，DH呈上升趨勢，在反應(yīng)4h時DH最高。隨著時間的延長，水解度的上升趨勢應(yīng)該趨于平緩，而圖中顯示有下降趨勢，主要原因可能是水解液水解時間過長，多肽分子進一步分解，影響了水解度的測定[10]。綜合考慮，適宜反應(yīng)時間為4h。

2.1.1.4 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)4h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖4所示，隨pH的逐漸增加，DH呈上升趨勢，在pH至7.0時DH開始下降。這是由于酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)分子，其酶催化反應(yīng)的能力與環(huán)境pH值密切相關(guān)，環(huán)境pH值會影響酶分子的構(gòu)像和酶分子及底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度，pH值過高、過低均對酶促反應(yīng)不利。因此，最適pH為7.0。

2.1.2 木瓜蛋白酶水解的單因素分析

2.1.2.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至7.0，分別加入6000U·g-1、7000U·g-1、8000U·g-1、9000U·g-1、10000U·g-1木瓜蛋白酶，55℃下反應(yīng)3h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖5所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為9000U·g-1以后增加不是很顯著。因此，適宜的酶用量為9000U·g-1。

2.1.2.2 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)3h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖6所示，隨pH的增加，DH呈上升趨勢，在pH至6.5時DH開始下降。由于pH過高、過低都會影響酶促反應(yīng)，水解度最大時即為最佳pH。因此，最適pH為6.5。

2.1.2.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至6.5，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖7所示，隨反應(yīng)時間的增加，DH呈上升趨勢。一般來講，加酶量相同，時間越長，水解率越高，但達到一定的時間后上升趨勢減緩，綜合考慮到能耗、生產(chǎn)周期及防止水解液變質(zhì)等因素，適宜反應(yīng)時間為3h。

2.1.2.4 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至6.5，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反應(yīng)3h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖8所示，隨反應(yīng)溫度的增加，在55℃時DH最高。溫度對酶促反應(yīng)的影響主要是溫度提高反應(yīng)速度加快，但溫度過高則會使酶失活加快，從而使水解度降低。因此，適宜反應(yīng)溫度為55℃。

2.1.3 菠蘿蛋白酶水解的單因素分析

2.1.3.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至6.5，分別加入1000U·g-1、2000U·g-1、3000U·g-1、4000U·g-1、5000U·g-1菠蘿蛋白酶，55℃下反應(yīng)4h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖9所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為3000U·g-1以后增加趨勢不是很顯著。從經(jīng)濟效益考慮，適宜酶用量為3000U·g-1。

2.1.3.2 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至6.5，均加入3000U·g-1菠蘿蛋白酶，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反應(yīng)4h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖10所示，隨反應(yīng)溫度的增加，在55℃時DH最高。隨著溫度的提高，酶促反應(yīng)速率加快，但溫度升高也加快了酶失活速率。因此，適宜反應(yīng)溫度為55℃。

2.1.3.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH至6.5，均加入3000U·g-1菠蘿蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。結(jié)果如圖11所示，隨反應(yīng)時間的增加，DH呈上升趨勢，在反應(yīng)時間為4h以后趨于平穩(wěn)。一般來講，要達到同樣的水解率，水解時間同酶的用量有關(guān)，酶的用量大，水解時間可以短些。加酶量相同，時間越長，水解率越高，但達到一定的時間后上升趨勢減緩，綜合考慮到能耗、生產(chǎn)周期及防止水解液變質(zhì)等因素，以水解時間不宜超過4h為宜。因此，適宜反應(yīng)時間為4h。

2.1.3.4 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調(diào)pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入3000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應(yīng)4h后，終止酶解反應(yīng)，測定水解度。

結(jié)果如圖12所示，隨pH的增加，DH呈上升趨勢，在pH至6.5時DH開始下降。pH影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度，pH值過高、過低均對酶促反應(yīng)不利。因此，最適pH為6.5。

2.1.4 三酶復(fù)合水解條件的確定

采用正交實驗方法，以水解度為測定指標，考察復(fù)合酶比例（A），反應(yīng)pH值（B），反應(yīng)溫度（C）和反應(yīng)時間（D）4個因素對水解度的影響。實驗數(shù)據(jù)如表5所示。

由表5可知，影響水解度的主次順序：A>C>D>B，即蛋白酶比例>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間>反應(yīng)pH值;三酶復(fù)合酶解大豆蛋白的最佳水解條件是：A2B1C2D3，即中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和波蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間4h，pH6.5，此條件下大豆蛋白液的水解度為42.12%。

2.2 接種乳酸菌發(fā)酵大豆蛋白水解液

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵條件的確定

向所得的大豆蛋白水解液中接種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌1∶1的比例進行乳酸發(fā)酵。采用正交實驗法，以酸度（以乳酸計）為測定指標?？疾旆磻?yīng)溫度（A）、接種量（菌種占大豆蛋白水解液百分比）（B）和反應(yīng)時間（C）3因素對發(fā)酵酸度的影響。實驗數(shù)據(jù)如表6所示。

由表6可以看出，對乳酸發(fā)酵影響的主次順序為A>B>C，即溫度>反應(yīng)接種量>反應(yīng)時間。選擇最佳發(fā)酵條件是A1B2C2。即溫度38℃，接種量4%，發(fā)酵時間為5h，菌種比1∶1。此時水解液乳酸發(fā)酵的酸度（以乳酸計）為0.82%。

2.2.2 產(chǎn)品配方優(yōu)選實驗

參考有關(guān)資料并結(jié)合乳酸菌發(fā)酵條件正交試驗的結(jié)果，選取蔗糖、乳粉、穩(wěn)定劑為正交試驗的3個因素，各取3個水平，選用L9（33）正交表安排實驗。由5～8人組成感官評定小組，根據(jù)產(chǎn)品的粘稠度、清液析出狀況、色澤、酸度、甜度、香味等方面的情況進行感官評分，采取10分制[12]。產(chǎn)品配方優(yōu)選正交實驗因素水平感官評定結(jié)果分析如表7所示。

根據(jù)表7中計算的各指標均值的極差（R）可以看出，各因素對產(chǎn)品品質(zhì)影響的主次順序：A（蔗糖%）=D（穩(wěn)定劑%）>B（乳粉%）。由水平均值（k）可以得出最優(yōu)水平組為：A3B2C3，即蔗糖6%，乳粉4%，穩(wěn)定劑0.9%。

3 結(jié)論

采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶三酶復(fù)合，對大豆蛋白進行酶解和乳酸發(fā)酵，研制出風(fēng)味良好，易消化吸收的大豆多肽酸奶新產(chǎn)品。最佳酶解條件是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間4h，反應(yīng)pH值為6.5;最佳發(fā)酵條件：溫度38℃，反應(yīng)接種量4%，發(fā)酵時間為5h，菌種比1∶1;最佳配方：蔗糖6%，乳粉4%，穩(wěn)定劑0.9%。

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（責(zé)任編輯 李媛媛）