薛麗娜，羅惠娣，周勝花，毛楊毅

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

綿羊除了產(chǎn)肉外，產(chǎn)毛也是其主要的經(jīng)濟(jì)性狀。毛色決定著羊毛的價(jià)格，也是品種的標(biāo)志，在綿羊選育中毛色的選擇具有重要意義。動(dòng)物毛色是由毛囊中的黑色素決定，黑色素包括真黑素和褐黑素，真黑素使毛色表現(xiàn)為黑色或褐色，而褐黑素則使毛色表現(xiàn)為黃色或紅色，二者按不同比例存在于毛囊中使毛色呈現(xiàn)出由深至淺、豐富多彩的顏色，黑素皮質(zhì)受體1基因（MC1R基因）和鼠灰色基因（Agouti基因）可調(diào)控這2種色素相對(duì)含量。包括綿羊在內(nèi)的大多數(shù)物種的MC1R基因只有一個(gè)外顯子，其編碼的蛋白具有7個(gè)跨膜功能域［1］。Agouti基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，其中2、3、4外顯子編碼ASIP分泌信號(hào)蛋白。MC1R基因與對(duì)抗炎癥相關(guān)，而Agouti基因與肥胖、糖尿病和腫瘤易感性等具有一定關(guān)系，但二者最主要的作用是調(diào)控色素合成［1，2］。在黑色素細(xì)胞膜上，MC1R蛋白與胞外促黑色素細(xì)胞激素（α-MSH）結(jié)合，促進(jìn)真黑素的合成，而ASIP分泌蛋白，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R受體合成更多的褐黑素［3］。關(guān)于MC1R和Agouti基因影響動(dòng)物被毛表型的研究較多，包 括 水 牛［4］、水 貂［5］、狐 貍［6］、馬［7］和 豚 鼠［8］等。關(guān)于綿羊的研究中［9］，MC1R和Agouti基因的單核苷酸位點(diǎn)突變均與毛色相關(guān)，同時(shí)這2個(gè)基因多數(shù)情況下會(huì)顯示上位互作效應(yīng)。

綿羊的毛色是一個(gè)重要的生產(chǎn)性狀，有白色、黑色、褐色和斑塊狀雜色［10］。白色羊毛中不含或含少量褐黑素，褐色和黑色羊毛則含有黑色素或兩種色素的混合，完全黑色的綿羊較為少見。山西地方綿羊一般為白色，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，以黑頭杜泊（公）與本地白色綿羊（母）雜交產(chǎn)生的白色羊（全身白色臉部黑色斑塊）為母本，以薩福克為父本，雜交產(chǎn)生的后代中部分是黑色被毛綿羊。因此，本試驗(yàn)以黑色被毛綿羊和其母本白色羊（圖1）為研究對(duì)象，分析該群體中綿羊MC1R和Agouti基因CDS區(qū)的SNPs和單倍型與毛色的關(guān)系，探索控制毛色的主效基因，為綿羊毛色分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

圖1 2種被毛顏色的試驗(yàn)綿羊Fig.1 Experimental sheep with two coat colors

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣本來自山西省廣靈縣同羊農(nóng)牧有限公司羊場(chǎng)，隨機(jī)選取上述雜交模式下產(chǎn)生的全黑色被毛綿羊及和其母本白羊各30只，采集各羊的頸靜脈血樣5 mL于抗凝管中，?20℃凍存，用于DNA提取試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血液基因組提取和引物設(shè)計(jì)

參照血液基因組DNA提取試劑盒指南（天根DP348）提取DNA。利用核酸蛋白測(cè)定儀和1%瓊脂糖凝膠對(duì)提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)NCBI查找綿羊MC1R和Agouti基因的mRNA序列，GenBank登 錄 號(hào) 分 別 為NM_001282528.1和NM001134303。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并擴(kuò)增上述2個(gè)基因的編碼區(qū)，引物MC1R用以擴(kuò)增MC1R基因唯一外顯子區(qū)域，引物Agouti-2、Agouti-3及Agouti-4擴(kuò)增Agouti基因2、3、4外顯子區(qū)域，引物由上海生物工程有限公司合成，合成引物如表1所示。

1.2.2 目的片段擴(kuò)增

以提取的DNA為模板，根據(jù)2×Taq PCR MasterMix的說明，建立50μL的反應(yīng)體系：上下游引物（10μmol·μL-1）各1μL，2×MasterMix 25μL，DNA和RNase Free dH2O共23μL（其 中 含100 ng的DNA）。反 應(yīng) 條 件：94℃5 min（預(yù) 變性階段）；94℃30 s，退火溫度（表1）30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)（PCR反應(yīng)階段）；72℃5 min。采用電泳檢測(cè)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，隨后送上海吉美生物公司對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后雙向測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件查看峰圖，分別用SeqVerter軟件和ClustalX2.1軟件對(duì)序列合并及比對(duì)。統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，運(yùn)用SPSS18.0中的χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)分析突變位點(diǎn)是否與毛色表型相關(guān)。用SHEsis在線軟件對(duì)突變位點(diǎn)連鎖不平衡和單倍型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

樣本DNA的濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，其濃度均在30～100 ng·μL-1范圍內(nèi)，OD260/OD280值均在1.8～1.9之間。提取產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)（圖2），DNA為一條較整齊的條帶，亮度較好，沒有降解，說明提取DNA濃度和純度較高，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

綿羊MC1R基因外顯子和Agouti基因2、3、4外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，4個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均為特異性產(chǎn)物，片段長(zhǎng)度與預(yù)期長(zhǎng)度一致。

表1 PCR擴(kuò)增的引物信息Table1 Primer information of PCR amplification

M：DNA maker DL2000；1～12為：部分基因組DNA M：DNA maker DL2000；1?12：partial genomic DNA

圖3 4個(gè)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of four PCR

2.3 MC1R和Agouti基因突變位點(diǎn)分析

60只綿羊MC1R和Agouti基因編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物送上海美吉公司純化后測(cè)序，分別用SeqVerter軟件和ClustalX2.1軟件對(duì)序列合并及比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Agouti基因2、3外顯子無SNPs突變位點(diǎn)，外顯子4有2個(gè)SNPs突變位點(diǎn)，其中g(shù).5051G＞C為同義突變，g.5172T＞A（P.C126S）為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸序列中126處由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸。MC1R基因編碼區(qū)有5個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)突變位點(diǎn)（c.429C＞T、c.600T＞G和c.735 C＞T）為同義突變，c.218T＞A（P.M73K）為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸序列中73處由甲硫氨酸變?yōu)橘嚢彼幔琧.361G＞A（P.D121N）為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸序列中121處由天冬氨酸變?yōu)樘於０罚魍蛔冊(cè)诨蚪M中的位置如圖4所示。

2.4 基因頻率和基因型頻率在黑色和白色綿羊群體中的分布

統(tǒng)計(jì)MC1R和Agouti基因各突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果如表2所示。MC1R基因有3個(gè)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因頻率大于0.8，c.218T＞A優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門，c.361G＞A優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镚，c.429C＞T優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃。Agouti基因g.5172T＞A位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門。利用Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)在黑色和白色毛色群體中的基因平衡狀態(tài)，7個(gè)突變位點(diǎn)經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Agouti基因2個(gè)突變位點(diǎn)及MC1R基因2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），說明這4個(gè)位點(diǎn)的突變與毛色性狀無相關(guān)性。MC1R基因3個(gè)同義突變位點(diǎn)均為P＜0.05，處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，說明MC1R基因中的這3個(gè)突變位點(diǎn)與毛色性狀具有相關(guān)性。

表2 不同毛色綿羊MC1R和Agouti基因突變位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因Table2 Genotype and allele frequencies of MC1R and Agouti gene mutations in sheep with different coat color

2.5 基因連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

關(guān)聯(lián)研究中，MAF太低會(huì)導(dǎo)致結(jié)果假陰性，一般選擇等位基因頻率大于0.05的SNPs來構(gòu)建單倍型［9］。在本試驗(yàn)中，Agouti基因2個(gè)突變位點(diǎn)中的g.5172T＞A突變位點(diǎn)MAF小于0.05，因此Agouti基因不能用來構(gòu)建單倍型。SHEsis在線軟件可對(duì)樣本中的突變位點(diǎn)配對(duì)連鎖不平衡分析和基因單倍型構(gòu)建，對(duì)MC1R基因中5個(gè)突變位點(diǎn)的連鎖不平衡Lewontin系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。本試驗(yàn)中的D′均大于0.7，說明MC1R基因5個(gè)SNP位點(diǎn)之間連鎖。進(jìn)一步對(duì)5個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型構(gòu)建，在該群體中發(fā)現(xiàn)8種單倍型，如果5個(gè)SNP位點(diǎn)沒有連鎖，應(yīng)該有25種單倍型，說明它們高度連鎖，由于群體中單倍型的頻率不能小于0.03［11］，因此，過濾掉單倍型小于0.03的數(shù)據(jù)后只有4種單倍型組合被分析（表3），經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，TGTGT單倍型頻率在黑色組中顯著低于白色組（p＜0.01），而TGCTT單倍型頻率在黑色組中的頻率顯著高于白色組（p＜0.05），初步推測(cè)這2種單倍型與毛色表型相關(guān)。

圖5 MC1R基因單倍型連鎖圖Fig.5 Haplotype linkage map of MC1R gene

表3 不同毛色綿羊MC1R基因突變位點(diǎn)單倍型分布情況Table 3 Haplotypes distribution of MC1R mutations in sheep with different coat color

3 討論

綿羊的MC1R基因是由Extension基因座編碼，包括等位基因ED和E＋，其中ED為顯性黑色等位基因，由于c.218T＞A（p.M37K）和c.361G＞A（p.D121N）位點(diǎn)突變引起，二者共同和單獨(dú)存在，均可激活MC1R受體，使綿羊表現(xiàn)為黑色或棕褐色被毛，E＋為野生型不發(fā)生突變［9］。本試驗(yàn)在黑色和白色綿羊中均發(fā)現(xiàn)MC1R基因編碼區(qū)有5個(gè)突變位點(diǎn)，其中3個(gè)突變位點(diǎn)（c.429C＞T、c.600T＞G和c.735 C＞T）為同義突變，2個(gè)錯(cuò)義突變c.218T＞A和c.361G＞A，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)錯(cuò)義突變均與被毛表型不相關(guān)。李洪濤等［12］和何軍敏等［13］對(duì)哈薩克羊的研究均表明，MC1R基因的c.218T＞A雜合突變與黑色毛色表型極相關(guān)，且在白色和棕色被毛羊中不存在該位點(diǎn)的突變。本試驗(yàn)在黑色和白色綿羊中均存在c.218T＞A突變位點(diǎn)且與毛色性狀不相關(guān)，這與哈薩克羊的結(jié)果不同。於建國(guó)等［14］和Yang等［15］研究均表明，吐魯番黑山羊和岷縣黑裘皮綿羊中MC1R基因均存在3個(gè)同義突變位點(diǎn)和2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，且單倍型AATGT與黑色被毛表型相關(guān)，在本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)有AATGT單倍型。付冬麗［16］對(duì)10個(gè)中國(guó)地方綿羊品種MC1R基因5個(gè)突變位點(diǎn)單倍型分析發(fā)現(xiàn)可以構(gòu)成3個(gè)單倍型：TGCTC、TGTGT和AATGT，且單倍型TGTGT多存在于頭部黑色身體白色的藏羊中，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGTGT單倍型與頭部黑色斑點(diǎn)身體白色的白羊毛色極相關(guān)，這與藏羊的研究結(jié)果一致。在與毛色相關(guān)的單倍型TGTGT和TGCTT中，突變位點(diǎn)均為同義突變。大量文獻(xiàn)表明［17，18］，同義突變雖然不會(huì)改變蛋白質(zhì)序列，但在特定環(huán)境下，同義突變能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能從而影響蛋白質(zhì)的生物合成。本研究中與毛色相關(guān)的同義突變是否通過這樣的機(jī)制調(diào)控毛色還需更進(jìn)一步驗(yàn)證。

綿 羊Agouti是 一 個(gè)復(fù) 等 位 基 因［19］。AWt等位基因?yàn)轱@性白等位基因，由Agouti基因的190 kb基因組區(qū)存在多個(gè)拷貝而使其受到臨近的多個(gè)ITCH啟動(dòng)子調(diào)控，導(dǎo)致綿羊毛色呈現(xiàn)白色或棕褐色等淺色被毛。Aa等位基因?yàn)榉墙?jīng)典Agouti隱性黑毛突變位點(diǎn)，由第2外顯子5 bp缺失（C.100-105 del AGGAA；D5）、9 bp的缺失（C.10-18 del AGCCGCCTC；D9）或 第4外 顯 子 錯(cuò) 義 突 變（g.5172T＞A）使綿羊呈現(xiàn)全黑色或棕色被毛。本試驗(yàn)2種不同毛色群體中，Agouti基因外顯子4上存在2個(gè)SNPs突變位點(diǎn)，其中g(shù).5051G＞C為同義突變，g.5172T＞A為錯(cuò)義突變，且2個(gè)位點(diǎn)均與毛色表型不相關(guān)，這與阿勒泰羊和藏羊中的研究結(jié)果一致［20，21］。Gratten等［22］發(fā)現(xiàn)野生索艾綿羊的Agouti基因D5和g.5172T＞A突變與黑色被毛表型相關(guān)。孟浩浩等［20，23］研究發(fā)現(xiàn)，新疆細(xì)毛羊和中國(guó)美利奴（軍墾型）羊Agouti基因D5缺失與黑色被毛毛色極顯著相關(guān)。本試驗(yàn)群體中未發(fā)現(xiàn)有D5突變。在美利奴羊和瑪薩斯羊中，多數(shù)黑色羊含有單拷貝的Agouti基因，而幾乎所有的白色羊含有 多 個(gè) 拷 貝 的 該 基 因［24，25］。本 試 驗(yàn) 綿 羊 群 體 中Agouti基因拷貝變異是否與毛色相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

Agouti基因外顯子的單核苷酸突變多態(tài)性與其被毛不相關(guān)，MC1R基因3個(gè)同義突變位點(diǎn)和2個(gè)單倍型與毛色性狀相關(guān)。