牛鐵荃，郭雯巖，李雪雪，王曉芳，Gary Gao，紀薇，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷030801；2.美國俄亥俄州立大學(xué)，哥倫布，OH43210）

中國葡萄種質(zhì)資源豐富，種類繁多，地理分布廣泛，其中蘊藏著大量的抗逆性優(yōu)異種質(zhì)［1，2］。我國大部分優(yōu)質(zhì)葡萄產(chǎn)區(qū)集中在北方地區(qū)，北方寒區(qū)的冬季極端低溫是限制葡萄栽培的重要環(huán)境因素之一［3，4］，且其發(fā)生頻率和破壞程度日益嚴重，嚴重影響種植效益［5］。隨著葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，葡萄嫁接栽培的應(yīng)用越來越普遍，采用優(yōu)良抗寒砧木嫁接栽培，能提高葡萄的抗寒越冬能力，進而影響其產(chǎn)量和品質(zhì)［6～8］。因此，選擇抗寒性砧木是寒區(qū)葡萄生產(chǎn)的一項關(guān)鍵工作。

近年來，葡萄抗寒性的鑒定與評價已有很多研究。范宗民等［9］利用主成分分析結(jié)合半致死溫度，對不同砧木的‘赤霞珠’葡萄枝條的耐寒性進行綜合評價，最終得出‘赤霞珠/5BB’嫁接植株的抗寒性最高；羅堯幸等［10］利用隸屬函數(shù)法確定了‘無核翠寶’等7個鮮食葡萄品種的抗寒能力強弱；任靜等［11］結(jié)合主成分分析法、聚類分析法以及相關(guān)性分析，評價了河西走廊‘貴人香’7個葡萄砧穗的抗寒性強弱；李桂榮等［12］利用灰色關(guān)聯(lián)分析篩選出與葡萄抗寒性關(guān)聯(lián)度最高的抗寒指標(biāo)是丙二醛、SOD，其次是POD、可溶性糖含量；曹建東等［13］篩選出相對電導(dǎo)率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量等指標(biāo)作為評價葡萄抗寒性強弱的指標(biāo)。通過嫁接獲得的植株在抗逆性等品質(zhì)方面會表現(xiàn)出類似砧木品種的優(yōu)良特性，而目前對葡萄實生砧木抗寒性綜合評判的研究少見報道。因此，本試驗利用葡萄實生苗分生力強、生長發(fā)育快等特點，在課題組前期種質(zhì)資源收集的基礎(chǔ)上，選取14種不同葡萄砧木品種的種子為試材，設(shè)置4℃、0℃、?4℃和?10℃的梯度低溫處理，觀測其萌發(fā)和抗寒生理生化指標(biāo)的動態(tài)變化，利用其變化來反映不同品種實生苗對低溫脅迫的響應(yīng)，得出不同品種葡萄砧木實生苗間的抗寒性差異，為葡萄育種提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取14個不同葡萄砧木品種為試驗材料（表1），取自山西省農(nóng)科院果樹研究所國家果樹種質(zhì)太谷葡萄資源圃（37°20′37″N，112°29′33″E，海拔833 m±4 m），所選植株生長勢強，采用單籬架式種植，株行距為1.5 m×2.5 m。

1.2 試驗方法

2017年9月8日采收葡萄完熟漿果，取出種子洗凈，沙藏后于次年3月28日挖出，用2 500 mg·L-1的GA3浸種24 h后將種子置于培養(yǎng)室進行催芽，各品種取籽500粒。露白后采用點播法播種，每日觀察種子出芽及生根情況，待實生苗長出1～2片真葉時移栽至營養(yǎng)缽中繼續(xù)培育。隨機選擇長勢優(yōu)良、健康無病害的14個葡萄砧木實生苗各30株，以25℃為對照，設(shè)置4℃、0℃、?4℃及?10℃的低溫處理，升降溫速率均為4℃·h-1，降溫至目標(biāo)溫度后維持12 h，然后升溫至25℃后再維持12 h后進行隨機取樣。各溫度處理時均無光照，取樣位置約為第3～5片葉。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 砧木種子萌芽情況及出苗率測定

催芽后每日觀察記錄種子的萌芽情況。播種后10 d計算出苗率，記錄生根數(shù)并測定根長［18］。

1.3.2 實生苗抗寒生理指標(biāo)的測定

葡萄葉片相對電導(dǎo)率的測定參照董萬鵬等［19］的方法，葉綠素含量的測定采用乙醇比色法，可溶性糖含量的測定采用蒽酮法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法，丙二醛（MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸法，游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮比色法，POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）光還原法，CAT活性測定采用H2O2法［20］。

1.3 數(shù)據(jù)處理

灰度關(guān)聯(lián)分析參照楊光華等［21］的方法，選取關(guān)聯(lián)度較高（＞0.40）的抗寒指標(biāo)，采用隸屬度分析法結(jié)合分層聚類，依照隸屬度均值將實生苗抗寒性分為三級［22］，平均值0.45～0.50為高抗寒品種，0.30～0.45為中抗寒品種，0.25～0.30為抗寒品種。

試驗對3次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Excel 2013軟件和SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，并用GraphPad Prism 7.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄砧木種子的萌發(fā)和實生苗的培育

由圖1可見，‘5BB’、‘140R’葡萄種子的萌發(fā)速度較快，分別在催芽后7 d和9 d觀察到子葉的萌發(fā)，而大部分種子在催芽后9 d只長出1條主根、2～3條側(cè)根，其中‘雙優(yōu)’的萌發(fā)速率最慢，催芽后9 d才觀察到種子露白的情況。由表2可見，播種后10 d，‘絳縣5號’成苗率最高，達到78.8%，其次為‘絳縣4號’，可達63.3%，左優(yōu)紅的成活率最低，僅為19.4%。各品種實生苗的生根數(shù)與根長存在差異，其中‘絳縣4號’、‘絳 縣5號’、‘絳 縣7號’的生根數(shù)均大于3.5，根長均長于2.5 cm，高于其他參試品種。

表1 供試葡萄砧木品種Table 1 The species of different grape rootstock varieties

圖1 不同葡萄品種種子萌發(fā)動態(tài)Fig.1 Germination dynamics of different varieties grape seeds

2.2 低溫對葡萄實生苗外觀形態(tài)的影響

由圖2可以看出，25℃時，實生苗莖葉和根系外觀形態(tài)正常，在4℃和0℃脅迫下，部分葡萄品種葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象；?4℃時，‘左優(yōu)紅’等部分品種莖葉開始出現(xiàn)萎蔫，呈灰褐色，根系有變黑現(xiàn)象出現(xiàn)；?10℃時，所有品種均出現(xiàn)莖葉失水變脆，根系變黑。

2.3 低溫對葡萄實生苗抗寒生理生化指標(biāo)的影響

由圖3可見，隨著溫度降低，各葡萄葉片的相對電導(dǎo)率表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，葉綠素含量則整體呈現(xiàn)下降的趨勢。葉片可溶性糖含量表現(xiàn)出顯著變化，隨脅迫溫度的降低，‘北醇’和‘絳縣4號’的葉片可溶性糖含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，而其余品種基本呈現(xiàn)相反的趨勢?！p優(yōu)’葉片的可溶性蛋白含量隨著脅迫進行表現(xiàn)出上升的趨勢，在?10℃時達到最高，其余品種則均表現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，與可溶性糖規(guī)律 一 致?！{ 縣 復(fù) 葉 葡 萄’、‘山 河1號’、‘絳 縣7號’的葉片脯氨酸含量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。葉片的MDA含量在脅迫前期，即從25℃降至4℃時，基本表現(xiàn)為活性上升；在整個脅迫范圍內(nèi)，含量均為總體累積。25℃時各品種葉片CAT活性均呈現(xiàn)較高的活性，脅迫前期，活性均大幅度下降，在0℃時基本都達到最低值。不同品種POD活性呈不同的變化趨勢，‘SO4’、‘雙優(yōu)’和‘山河4號’的POD活性先上升后下降，‘左優(yōu)紅’、‘5BB’、‘北醇’、‘絳縣 復(fù) 葉 葡 萄’、‘140R’、‘絳 縣4號’、‘絳縣5號’、‘絳縣7號’和‘絳縣10號’則表現(xiàn)相反的趨勢，兩種變化差異顯著，‘山河1號’葉片POD活性則隨溫度降低而不斷上升且無顯著差異。葡萄葉片的SOD活性基本在25℃時含量達到最高，在脅迫溫度到達4℃時，含量均迅速下降，之后基本趨于穩(wěn)定。

表2 不同葡萄實生苗成活率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 2 Survival rate of different grape seedling（Means±SE）

圖2 低溫處理對葡萄實生苗外觀形態(tài)的影響Fig.2 Effect of low temperature treatment on the appearance of grape seedlings

2.4 葡萄實生苗抗寒性綜合評價

由表2可以看出，根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果，抗寒指標(biāo)由高到低排序為：SOD活性＞可溶性糖＞葉綠素＞相對電導(dǎo)率＞可溶性蛋白＞脯氨酸＞丙二醛＞CAT活性＞POD活性。

對14個葡萄品種的抗寒平均隸屬度排序進行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，14個葡萄品種可以分為3類，‘絳縣4號’為高抗寒品種，‘5BB’、‘左優(yōu)紅’、‘絳縣7號’、‘絳縣5號’、‘山河4號’、‘北 醇’、‘山 河1號’、‘絳 縣 復(fù) 葉 葡 萄’、‘140R’和‘雙豐’為中抗寒品種，‘SO4’、‘雙優(yōu)’和‘絳縣10號’為抗寒品種。

3 討論

葡萄實生苗的生長過程中，光照、溫度、水分和培育基質(zhì)的特性等均是影響實生苗成活的關(guān)鍵因素［23］。本試驗中葡萄實生苗成苗率參差不齊，經(jīng)分析與移栽后緩苗不當(dāng)和基質(zhì)保水性差有關(guān)，使得移栽后造成一定數(shù)量的實生苗死亡。據(jù)此，葡萄實生苗栽培條件仍需進一步的研究和改進。

圖3 低溫處理對葡萄實生苗葉片抗寒生理指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of low temperature treatment on physiological indexes of cold resistance of grape seedling leaves

植物膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害的原發(fā)部位，相對電導(dǎo)率能較直觀且準(zhǔn)確地反映出植物細胞膜在低溫下的受脅迫程度，電導(dǎo)率越大，細胞膜受害程度越深，抗寒性越弱，反之抗寒性越強［24，25］。本試驗結(jié)果表明14種葡萄葉片相對電導(dǎo)率隨溫度的降低而呈現(xiàn)升高的趨勢，可見低溫脅迫使葡萄實生苗葉片生物膜透性增大并且膜受損程度加重。低溫環(huán)境不僅會造成葉綠素和類胡蘿卜素的含量比例失衡，還會導(dǎo)致與蛋白質(zhì)結(jié)合的葉綠體色素含量發(fā)生變化，大部分植物在低溫脅迫下葉綠素含量會降低［26］。本試驗結(jié)果表明，隨著溫度降低，參試葡萄葉片葉綠素含量呈現(xiàn)下降的趨勢，分析原因可能是低溫使其代謝緩慢，合成葉綠素的原料不足，造成葉綠素含量減少，驗證了上述說法。

在低溫環(huán)境下，植物體內(nèi)各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，賦予植物多種滲透調(diào)節(jié)的能力，如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸等均是重要的抗寒指標(biāo)［27］。有研究表明［28］低溫處理下可溶性糖、可溶性蛋白含量和脯氨酸等植物體代謝物質(zhì)變化越大，植物組織抗寒性越強，變化越小抗寒性越弱。本試驗中隨著脅迫溫度的降低，從整體上看，供試葡萄葉片的可溶性糖含量基本呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，最終含量相較初始值基本增加，表明植株通過積累可溶性糖含量來提高細胞的滲透勢；可溶性蛋白與游離脯氨酸含量在0～4℃期間基本處于上升的趨勢，有利于抗寒，但在5個溫度間，脯氨酸含量變化趨勢無明顯規(guī)律，與趙國棟等［29］的研究結(jié)果一致。

丙二醛含量被作為衡量植物抗寒性的重要參數(shù)［29］。有研究表明低溫處理后，植物體內(nèi)MDA含量會增加。本試驗中葡萄砧木MDA含量在低溫處理下變化的趨勢從整體上來看，脅迫后的MDA含量均高于低溫脅迫初始時的含量，即隨著脅迫的進行，MDA含量逐漸累積，而增加幅度不一，與高述民等［30］的研究一致。SOD、POD和CAT共同構(gòu)成植物組織的活性氧清除系統(tǒng)，使活性氧處于動態(tài)平衡，進而保護膜結(jié)構(gòu)免受低溫的破壞［31，32］。本試驗結(jié)果表明，參試葡萄的SOD活性與CAT活性的變化趨勢從整體上看基本呈現(xiàn)一致的趨勢，低溫脅迫前期均呈現(xiàn)較高的活性，隨著脅迫進行活性迅速下降，隨著溫度持續(xù)降低而逐漸保持穩(wěn)定，呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，表明環(huán)境溫度誘導(dǎo)了這兩種酶活性的變化，使得細胞膜處于活性氧積累和清除的動態(tài)平衡中，從而保護細胞不受到傷害。而POD活性則表現(xiàn)不一樣的變化情況，但均呈現(xiàn)一定的規(guī)律性且之間差異明顯，這也一定程度上反映了葡萄植株中氧化反應(yīng)的生理變化，抗氧化酶的變化說明植株對低溫產(chǎn)生了一定的響應(yīng)。

表3 不同品種葡萄生理生化指標(biāo)與抗寒性的灰色關(guān)聯(lián)度Table 3 Grey correlation degree between physiological and biochemical indexes and cold resistance of different grape varieties

鐘海霞等［33］通過對7個葡萄砧木根系的抗寒性研究得出，‘5BB’根系的抗寒力強于‘SO4’。李鵬 程 等［16］的 研 究 評 價 了‘5BB’、‘山 河1號’及‘SO4’等8種引進葡萄砧木的抗寒性，得出‘5BB’、‘山河1號’的抗寒性均強于‘SO4’。本試驗通過聚類分層分析將‘5BB’、‘山河1號’聚為中抗寒品種，‘SO4’為抗寒品種，與前人研究結(jié)果具有一致性。蘇李維等［34］對‘雙優(yōu)’、‘左優(yōu)紅’等葡萄一年生枝條進行抗寒性評價得出，‘雙優(yōu)’枝條的抗寒性優(yōu)于‘左優(yōu)紅’。而本試驗通過聚類分層得出，‘左優(yōu)紅’為中抗寒品種，‘雙優(yōu)’為抗寒品種，與前人研究有差異，分析原因可能是選材差異。前人研究選擇一年生成年枝條，而本試驗選擇砧木實生苗為試材，可能是所取材實生苗的木質(zhì)部比一年生枝條抗寒力稍強，在可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸等含量稍有差異，造成所得結(jié)果不一致。由于植物是一個復(fù)雜的有機體，易受到逆境脅迫引起的植物生理指標(biāo)變化，在具體評定葡萄抗寒性時，還需要結(jié)合田間觀察等綜合評價，以獲得更為科學(xué)、精準(zhǔn)的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究運用隸屬函數(shù)法與聚類分析法對14個品種進行比對篩選，分別得出了高抗寒、中抗寒與抗寒品種，以此來作為綜合評價的最終結(jié)果。最終綜合葡萄種子萌發(fā)情況、實生苗成活率和抗寒性等指標(biāo)，篩選出‘絳縣4號’為葡萄實生耐寒砧木品種。這一結(jié)果為加速葡萄抗寒性研究提供了科學(xué)依據(jù)。關(guān)于葡萄砧木品種抗寒的分子生物學(xué)機理有待繼續(xù)研究，今后將繼續(xù)探究其分子機制。